Seoladh reatha†: OX11 0DE, an Ríocht Aontaithe, Foirgneamh Diamond, Páirc Eolaíochta agus Nuálaíochta Harwell, Dietcote, Oxfordshire, an Ríocht Aontaithe, Diamond Light Source Co., Ltd., Ionad Íomháithe Bitheolaíoch Leictreonach.
Is é coimpléasc bailithe solais 1 an ionaid imoibrithe (RC-LH1) croí-chomhpháirt fhótaisintéiseach na mbaictéar fótatrófach corcra. Thugamar isteach dhá struchtúr crió-mhicreascópachta leictreon den choimpléasc RC-LH1 ó Rhodopseudomonas palustris. Tá 14 lúb fho-aonad LH1 timpeall ar RC, atá curtha isteach ag próitéin W, i struchtúr taifeach 2.65-Å an choimpléasc RC-LH114-W, agus tá comhdhéanamh RC iomlán timpeallaithe ag RC sa choimpléasc gan próitéin-W. Lúb dúnta 16 fho-aonad LH1. Tugann comparáid na struchtúr seo léargas ar dhinimic quinone sa choimpléasc RC-LH1, lena n-áirítear athruithe comhréireacha nár cinneadh roimhe seo agus quinone ceangailte ag suíomh RC QB, chomh maith le suíomh suíomhanna ceangailteach quinone cúnta, a chabhraíonn le hiad a thabhairt chuig RC. Cuireann struchtúr uathúil an phróitéine W cosc ​​ar dhúnadh an lúb LH1, rud a chruthaíonn cainéal chun an malartú quinone/quinolone a luathú.
Is féidir leis an bhfuinneamh a sholáthraíonn fótaisintéis beagnach gach saol ar domhan a chothú, agus tá acmhainneacht mhór aici do bhiteicneolaíocht gréine. Cé go gcuireann sí fótaisintéis dhomhanda chun cinn, taispeánann baictéir fhótatrófacha corcra modhanna fuinnimh agus cumais meitibileach éagsúla freisin. Is féidir leo fótaisintéis a sheachaint agus fás mar bhaictéir heitreatrófacha sa dorchadas, is féidir leo nítrigin agus dé-ocsaíd charbóin a shocrú, hidrigin a tháirgeadh, agus comhdhúile aramatacha a dhíghrádú (1-3). Chun fuinneamh a sholáthar do na próisis seo, ní mór solas a thiontú go fuinneamh ceimiceach go tapa agus go héifeachtúil. Tosaíonn an próiseas seo nuair a ionsúnn an coimpléasc antenna gaiste solais solas agus a aistríonn sé an fuinneamh gafa chuig an ionad imoibrithe (RC), rud a thosaíonn scaradh luchta (4-7). Tá an t-aonad bunúsach fótaisintéise i mbaictéir fhótatrófacha corcra comhdhéanta de RC cineál 2, timpeallaithe ag coimpléasc bailithe solais 1 (LH1), ag foirmiú an choimpléasc croí RC-LH1. Tá LH1 déanta ag sraith de heitreatóiméirí αβ cuartha, agus ceanglaíonn gach ceann acu dhá mhóilín clóraifill baictéarach (BChl) a agus caratinoid amháin nó dhó (8-12). Is éard atá san aeróg LH1 is simplí ná 16 nó 17 heitridéiméir αβ a thimpeallaíonn RC (9-13) i lúb dúnta, ach i gcoimpléisc chroí eile, cuireann peiptídí trasmembrane isteach ar leanúnachas an LH1 máguaird, rud a chuireann chun cinn an idirleathadh quinol/quinone idir RC agus an coimpléasc cytochrome bc1 (11, 13-15). Is orgánach samhail é an planda fótatrófach corcra Rhodopseudomonas (Rps.) ar féidir leis an aistriú fuinnimh agus leictreon a thacaíonn le fótaisintéis a thuiscint. An chéad struchtúr criostail de Rps. Is é RC samhail an choimpléasc palustris RC-LH1, timpeallaithe ag 15 lúb heitridéiméireach LH1, atá curtha isteach ag próitéin anaithnid ar a dtugtar “Próitéin W” (14). Aithníodh Próitéin-W ina dhiaidh sin mar RPA4402, ar próitéin neamhthréithrithe 10.5kDa é le trí héilics trasmembrane tuartha (TMH) (16). Molaimid an ghéin rpa4402 a ionchódaíonn próitéin W a athainmniú go pufW chun go mbeidh sé comhsheasmhach leis an ainmníocht a úsáidtear le haghaidh géinte a ionchódaíonn fo-aonaid RC-L, M (pufL, pufM) agus LH1α, β (pufA, pufB). Is suimiúil go bhfuil próitéin-W i láthair ach i thart ar 10% de RC-LH1, rud a léiríonn go dtáirgeann Rps. palustris dhá choimpléasc RC-LH1 éagsúla. Anseo, tuairiscímid struchtúir crió-EM (crio-EM) ardtaifigh dhá choimpléasc chroí, ceann le próitéin W agus 14 heitreadéiméir αβ, an ceann eile gan próitéin W agus lúb dúnta 16 heitreadéiméir LH1. Léiríonn ár struchtúr athrú céime i dtuiscint ar choimpléasc RC-LH1 Rps. palustris, toisc gur anailísíomar daonra aonchineálach gach athraitheach agus go bhfuil réiteach leordhóthanach againn chun gach peiptíd agus líocha ceangailte agus lipidí agus cuinóin ghaolmhara a shannadh go soiléir. Léiríonn an comparáid idir na struchtúir seo go ngineann na trí phróitéin TMH-W nach bhfuarthas in aon choimpléasc RC-LH1 eile go dtí seo cainéal quinone chun malartú quinone/quinolone a luathú. Aithníodh roinnt suíomhanna ceangailteach lipid agus quinone caomhnaithe, agus nochtamar athrú comhréireach nua tar éis chomhcheangal quinone agus RC, a d'fhéadfadh a bheith oiriúnach do RC fótachórais II (PSII) d'orgánaigh fhótatrófacha ocsaiginithe. Tugann ár dtorthaí léargas nua ar chinéitic cheangail agus mhalartaithe quinone/quinolone i gcoimpléasc lárnach RC-LH1 de bhaictéir fhótatrófacha corcra.
Chun staidéar mionsonraithe a dhéanamh ar an dá choimpléasc a fhaightear i Rps. palustris, leithlisímid gach RC-LH1 trí mhodhanna bithcheimiceacha. Glanadh an coimpléasc easnamhach próitéine W (dá ngairtear ΔpufW anseo feasta) ón strain nach bhfuil an géin pufW ann (16), agus ní féidir ach coimpléasc RC-LH1 amháin a tháirgeadh. Déantar an coimpléasc ina bhfuil próitéin W a tháirgeadh ag strain. Déantar próitéin W an strain seo a mhodhnú le clib 10x His ag a C-chríoch, ionas gur féidir an coimpléasc ina bhfuil próitéin W a chomhcheangal go héifeachtach leis an gcuid is mó de na próitéine W atá in easnamh trí mhiotal a dhíghluaiseacht. Déantar an coimpléasc a dheighilt go héifeachtach (16) Crómatagrafaíocht Ghaolmhar (IMAC).
Mar a thaispeántar i bhFíor 1, tá trí fho-aonad RC (RC-L, RC-M agus RC-H) timpeallaithe ag antenna LH1 sa dá choimpléasc. Taispeánann struchtúr 2.80-A an choimpléasc ina bhfuil easpa próitéine-W 16 heitreidiméir αβ, ag cruthú lúb dúnta LH1 atá timpeallaithe go hiomlán ag RC, dá ngairtear an coimpléasc RC-LH116 anseo feasta. Tá 14-heitreidiméir LH1, atá curtha isteach ag próitéine-W, ag struchtúr 2.65Å an choimpléasc ina bhfuil próitéin-W, dá ngairtear RC-LH114-W anseo feasta.
(A agus B) Léiriú dromchla na comhdhúile. (C agus D) Líocha nasctha léirithe i slata. (E agus F) Tá na peiptídí agus na fo-aonaid LH1 léirithe i gcartúin sna coimpléisc a breathnaíodh ón dromchla cíteaplasmach, agus tá siad uimhrithe deiseal ón mbearna próitéine-W [ag teacht le huimhriú Rba. coimpléasc sphaeroides (13)]. I gcás LH1-α, is buí dath an fho-aonaid próitéine; i gcás LH1-β, is gorm dath an fho-aonaid próitéine; i gcás próitéine-W, is dearg an próitéin; i gcás RC-H, is cian é; i gcás RC-L, is oráiste é; i gcás RC-M, maigeanta. Léirítear comhfhachtóirí le slata, seasann glas do mhóilíní BChl agus BPh a, seasann corcra do charotenoidí, agus seasann buí do mhóilíní UQ10. (G agus H) Radharc formhéadaithe ar an mbearna próitéine-W sa réigiún coibhéiseach de choimpléasc RC-LH114-W (G) agus coimpléasc RC-LH116 (H). Taispeántar comhfhachtóirí i bhfoirm líonta spáis, taispeántar quinone cealaithe i ngorm. Tá an bhearna próitéin-W aibhsithe le líne phósta gorm i (G), agus tá na poill bheaga ina scaipeann quinone/quinolol ar an bhfáinne LH116 aibhsithe le líne phósta dubh i (H).
Taispeánann Fíor 1 (A agus B) an RC timpeallaithe ag eagair oscailte nó dúnta de heitreadiméirí LH1αβ, agus ceanglaíonn gach ceann acu dhá BChl agus caratanóideach amháin (Fíor 1, C agus D). Léirigh staidéir roimhe seo gurb é Rps an coimpléasc LH1. I gconair bhithshintéiseach xanthin spirulina, tá daonraí measctha de charatanóidigh sna speicis seo (17). Mar sin féin, is é spiropyrroxanthin an caratanóideach ceannasach agus tá a dlús sásúil. Dá bhrí sin, roghnaíomar spiroxanthin a shamhaltú ag gach suíomh ceangailteach LH1. Is TMHanna aonair iad na polaipeiptídí alfa agus béite le réigiúin sheachtracha membrane gearra (Fíor 1, A, B, E, agus F). Cé nár breathnaíodh dlús 17 iarmhar ag an C-chríoch, scoilteadh an polaipeiptíd alfa ó Met1 go Ala46 sa dá choimpléasc. Laghdaíodh polaipeiptíd β ó Gly4 go Tyr52 i RC-LH116, agus ó Ser5 go Tyr52 i RC-LH114-W. Níor breathnaíodh dlús 3 nó 4 iarmhar N-críochfoirt ná 13 iarmhar C-críochfoirt (Fíor S1). Léirigh anailís mais-speictriméadrachta ar an gcoimpléasc measctha RC-LH1 a ullmhaíodh ón strain fhiáin gur toradh scoilteadh heitrealógach na peiptídí seo a bhí sa réigiún atá ar iarraidh (Fíor S1 agus S2). Breathnaíodh foirmliú N-críochfoirt α-Met1 freisin (f). Léirigh an anailís go bhfuil an α-peiptíd comhdhéanta d'iarmhair fMet1 go Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, agus go bhfuil an β-peiptíd comhdhéanta d'iarmhair Ser2 go Ala53, rud atá i gcomhréir mhaith leis an léarscáil dlúis EM ísealteochta.
Déanann comhordú α-His29 agus β-His36 BChlanna aghaidh ar aghaidh; cruinníonn gach heitridéiméir αβ lena chomharsana chun lúb oscailte (RC-LH114-W) nó lúb dúnta (RC-LH116) a fhoirmiú timpeall an RC. An t-eagar líocha cúpláilte eicsitón (Fíor 1, C agus D). I gcomparáid leis an mbanda 877 nm de RC-LH114-W, is é 3 nm an t-aistriú dearg ionsúcháin 880 nm de RC-LH116 (Fíor 2A). Mar sin féin, tá an speictream déchróise ciorclach beagnach mar a chéile (Fíor 2B), rud a léiríonn cé go bhfuil difríocht shoiléir idir lúba oscailte agus dúnta, go bhfuil timpeallacht áitiúil BChlanna an-chosúil. D’fhéadfadh an t-aistriú dearg ionsúcháin a bheith mar thoradh ar ghluaiseacht theirmeach laghdaithe agus ar chobhsaíocht mhéadaithe ar an lúb dúnta (18, 19), an t-athrú i gcúpláil líocha de bharr an lúb dúnta (20, 21), nó meascán den dá éifeacht seo (11).
(A) Speictream ionsúcháin ultraivialait/infheicthe/gar-infridhearg, a bhfuil a bhuaicphointí marcáilte lena líocha comhfhreagracha agus normalaithe go dtí an bhuaic BPh ag 775 nm. (B) Speictream déchróise ciorclach normalaithe go dtí ionsú BChl ag 805 nm. (C agus D) Speictrim ΔA roghnaithe ó na speictrim ionsúcháin réitithe ama de choimpléasc RC-LH114-W (C) agus choimpléasc RC-LH116 (D). Chun comparáideacht níos fearr a dhéanamh, tá na speictrim uile normalaithe go ∆A de −A ag 0.2 ps. (E) Ráta ocsaídiúcháin cíteacróim c2 tar éis ionradaíochta i láthair tiúchain éagsúla de UQ2 (féach Fíor S8 le haghaidh sonraí amha). (F) I gcealla a fhástar faoi sholas íseal, meánach nó ard-déine (10, 30 nó 300μMm-2 s-1, faoi seach), na fo-aonaid próitéine W agus RC-L sa choimpléasc íonaithe agus an cóimheas membrane scartha. Cinntigh an leibhéal próitéine trí leictreafóiréis glóthach pola-aicrilimíde SDS agus imdhíon-mheas (féach Fíor S9 le haghaidh sonraí amha). Cinntigh an cóimheas i gcoibhneas leis an gcoimpléasc íonaithe RC-LH114-W. Is é 1:1 an cóimheas stoicheiméadrach de RC-L le próitéin-W an choimpléasc.
Tá na BChlanna ag suíomh 1 sa lúb αβ14 dífhoirmithe de RC-LH114-W (Fíor 1, A, C, agus E) níos gaire don phríomhdheontóir RC (P) faoi 6.8 Å ná na BChlanna coibhéiseacha i RC-LH116 (Fíor 1, B, D, agus F, agus Fíor S3); áfach, léiríonn cinéitic ionsúcháin neamhbhuana an dá choimpléasc go bhfuil tairiseacha ama aistrithe fuinnimh spreagtha ó LH1 go RC idir 40 ±4 agus 44 ± 3 ps (Fíor 2), i gcás RC-LH114-W agus RC-LH116. , C agus D, Fíor S4 agus Tábla S2). Níl aon difríocht shuntasach ann maidir le haistriú leictreonach laistigh de RC ach an oiread (Fíor S5 agus téacs forlíontach gaolmhar). Tá amhras orainn go bhfuil an chomhfhreagras dlúth idir an t-am aistrithe fuinnimh idir LH1 agus RC-P mar gheall ar an achar, an uillinn agus an fuinneamh poitéinsiúil comhchosúil atá ag formhór na BChl sna lúb LH1. Is cosúil nach bhfuil iniúchadh a dhéanamh ar phatrún fuinnimh LH1 chun an fad íosta a bhaint amach níos tapúla ná aistriú fuinnimh díreach ó shuíomhanna fo-optamacha go RC. Féadfaidh an lúb oscailte LH1 i RC-LH114-W gluaiseacht theirmeach neamhshuntasach a dhéanamh faoi dhálaí teochta ísle le haghaidh anailíse struchtúraí, agus tá comhréireacht fáinne αβ14 níos faide ag teocht an tseomra ón bhfad líocha de βBChls ag suíomh RC 1.
Tá 32 BChl agus 16 carotenoid sa choimpléasc RC-LH116, agus tá a shocrú foriomlán mar an gcéanna leis an gceann a fhaightear ó Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) agus algaí glasa (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Tar éis ailíniú, níor breathnaíodh ach dialltaí beaga i suíomhanna heitreadiméirí αβ, go háirithe 1-5, 15, agus 16 (Fíor S6). Tá tionchar suntasach ag láithreacht próitéine-W ar struchtúr LH1. Tá a thrí TMH ceangailte le lúba gearra, leis an N-críochfort ar thaobh lumen an choimpléasc agus an C-críochfort ar an taobh cíteaplasmach (Fíor 1A agus 3, A go D). Is hidrofóbach den chuid is mó é Próitéin-W (Fíor 3B), agus idirghníomhaíonn TMH2 agus TMH3 le LH1αβ-14 chun dromchla trasmembrane a fhoirmiú (Fíor 3, B agus E go G). Is iarmhair Phe, Leu agus Val sa réigiún trasmembrane den chuid is mó atá sa chomhéadan. Tá na hiarmhair seo cruachta le haigéid aimín hidrofóbacha agus líocha αβ-14. Cuireann roinnt iarmhair pholacha leis an idirghníomhaíocht freisin, lena n-áirítear an nasc hidrigine idir W-Thr68 agus β-Trp42 ar dhromchla an chuas casta (Fíor 3, F agus G). Ar dhromchla an chíteaplasma, tá Gln34 in aice leis an ngrúpa céató de charotenoidí αβ-14. Ina theannta sin, réitíodh an mhóilín n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM), agus shín a eireaball hidrofóbach go dtí an comhéadan idir próitéin-W agus αβ-14, agus d'fhéadfadh an t-eireaball lipid a bheith suite sa chorp. Thugamar faoi deara freisin go bhfuil réigiúin réitigh C-críochfoirt próitéine W agus RCH an-ghar dá chéile, ach nach bhfuil siad laistigh de raon feidhme idirghníomhaíochtaí sonracha a fhoirmiú (Fíor 1, A agus E). Mar sin féin, d'fhéadfadh idirghníomhaíochtaí a bheith sna aimínaigéid neamhréitithe C-críochfoirt an dá phróitéin seo, rud a d'fhéadfadh meicníocht a sholáthar chun próitéin-W a earcú le linn tionól an choimpléasc RC-LH114-W.
(A) Tá slabhra taobh slatchruthach (dearg) ag Próitéin-W, atá os comhair an chomhéadain le LH1αβ14 i bhfoirm cartúin, agus taispeántar é i gcuid den léaráid poitéinsil leictreastatach (dromchla liath trédhearcach le leibhéal comhrianta de 0.13). (B) Próitéin-W léirithe ag dromchla daite hidreafóbach. Taispeántar limistéir pholacha agus luchtaithe i gcian, taispeántar limistéir hidreafóbach i mbán, agus taispeántar limistéir atá láidir hidreafóbach in oráiste. (C agus D) Próitéin-W léirithe sa chartún, tá a threoshuíomh mar an gcéanna leis an gceann atá i (A) (C), agus rothlaithe 180° (D). De réir an tsuímh sa seicheamh, glacann na hiarmhair idirdhealaithe scéim dathanna tuar ceatha, áit a bhfuil an críochfort N gorm agus an críochfort C dearg. (E) Próitéin-W san amharc céanna leis an gceann atá i (A), agus na hiarmhair ag an gcomhéadan próitéin-W:LH1 léirithe ag slata le marcanna ceangailte. (F) Tá Próitéin-W rothlaithe 90° i gcoibhneas le (E) agus LH1αβ14 sa léiriú cartúin, agus i gcoibhneas leis na hiarmhair chomhéadain sa léiriú barra. Tá na hiarmhair atá ag crochadh ón bpolaipeiptíd béite lipéadaithe. Taispeántar an comhfhachtóir mar bharra a mheaitseálann dath Fíor 1, taispeántar an β-DDM dianscaoilte i liath, agus taispeántar an ocsaigin i ndearg. (G) Tá an radharc i (F) rothlaithe 180°, leis na hiarmhair fheiceálacha den pholaipeiptíd alfa lipéadaithe.
Cuireann Próitéin-W ionad heitridéiméir αβ (an 15ú ceann i bhFíor 1F), rud a chuireann cosc ​​ar dhúnadh lúb agus a chlaonann na chéad trí heitridéiméir αβ. Breathnaíodh gurbh é 25° go 29° (Fíor 1, A agus E) uillinn chlaonta uasta an chéad heitridéiméir αβ-1 i gcoibhneas leis an ngnáthlíne scannáin, a cruthaíodh leis an gclaonadh 2° go 8° de αβ-1 i RC A géarchodarsnacht-LH116 (Fíor 1, B agus F). Tá an dara agus an tríú heitridéiméir claonta ag 12° go 22° agus 5° go 10°, faoi seach. Mar gheall ar bhac steiriúil RC, ní chuimsíonn claonadh αβ-1 an dara péire de αβ (a fhreagraíonn don 16ú αβ i bhFíor 1F), rud a chruthaíonn bearna shoiléir sa fáinne LH1 (Fíor 1, A agus E). Mar gheall ar easpa dhá heitreadiméir αβ, in éineacht le cailliúint ceithre BChl agus dhá charotenoid, ní cheanglaíonn aon cheann de na carotenoidí leis an bhfo-aonad casta αβ-1, rud a fhágann fáinne LH114-W ina bhfuil 13 charotenoid Veigeatórach agus 28 BChl. Tá na meastacháin réitigh áitiúla ar an dá choimpléasc sna réigiúin αβ1 go 7 níos ísle ná iad siúd atá sa chuid eile den lúb LH1, rud a d'fhéadfadh a léiriú ar phlaisteachtacht dhúchasach an fho-aonaid LH1 in aice leis an suíomh RC QB (Fíor 4).
Taispeántar na pictiúir de RC-LH114-W (A agus B) agus RC-LH116 (C agus D) ón radharc barr/taobh céanna (A agus B) (A agus C) agus dromchla cuasa Fíor 1 (B agus D). Taispeántar na heochracha daite ar dheis.
Is é an t-aon choimpléasc croí tréith eile a bhfuil cóimheas stoicheiméadrach de 1:14 aige ná démhéir Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Mar sin féin, níl aon homalógacht shoiléir ag próitéin W agus PufX, agus tá tionchar suntasach acu ar a struchtúir LH1 faoi seach. Is TMH aonair é PufX le fearann ​​​​cíteaplasmach N-críochfoirt a idirghníomhaíonn leis an taobh cíteaplasmach den fho-aonad RC-H (13) ag suíomh a fhreagraíonn do Rps. palustris LH116αβ-16. Cruthaíonn PufX cainéal don mhalartú quinone/quinolone idir RC-LH1 agus an coimpléasc cytochrome bcl agus tá sé i láthair i ngach coimpléasc croí Rba. sphaeroides (13). Cé go bhfuil an comhéadan monaiméir-monaiméir i Rba. Tá an démhéir sphaeroides RC-LH1-PufX suite ag suíomh ceangailteach próitéine W i RC-LH114-W, agus tá an bhearna a spreagann PufX agus próitéin-W ag suíomh coibhéiseach (Fíor S7A). Tá an bhearna i RC-LH114-W ailínithe freisin leis an gcainéal quinone hipitéiseach (8) de Pseudomonas rosea LH1, atá déanta ag peiptídí nach bhfuil gaolmhar le próitéin W ná PufX (Fíor S7B). Ina theannta sin, tá an cainéal quinone i Blc. Tá an LH1 emerald glas a cruthaíodh trí fho-aonad γ amháin a eisiamh (7) suite i suíomh comhchosúil (Fíor S7C). Cé go bhfuil próitéiní éagsúla ag idirghabháil ann, is cosúil gur sampla d'éabhlóid chomhtháite é cuma na gcainéal quinone/quinolol seo i suíomh coiteann sa choimpléasc RC-LH1, rud a léiríonn gur féidir leis an bhearna a chruthaigh próitéin W gníomhú mar chainéal quinone.
Ceadaíonn an bhearna sa lúb LH114-W foirmiú réigiúin leanúnaigh scannáin idir spás inmheánach an choimpléasc RC-LH114-W agus an scannán mórchóir (Fíor 1G), seachas an dá fhearann ​​a nascadh trí phóir próitéine mar atá i bpróitéiní. Tá an coimpléasc RC-LH116 cosúil le coimpléasc Tch. dúnta cosúil le snáthaid (22) (Fíor 1H). Ós rud é go bhfuil scaipeadh quinone tríd an scannán níos tapúla ná an scaipeadh tríd an gcainéal próitéine caol, is féidir leis an lúb oscailte LH114-W láimhdeachas RC níos tapúla a cheadú ná an lúb dúnta LH116, agus d'fhéadfadh scaipeadh quinone isteach sa RC a bheith níos srianta. Chun tástáil a dhéanamh an mbíonn tionchar ag próitéin W ar chomhshó quinones trí RC, rinneamar measúnacht ocsaídiúcháin cíteacróim ar thiúchan áirithe de ubiquinone 2 (UQ2) (analógach de UQ10 nádúrtha le heireaball isoprene níos giorra) (Fíor 2E). Cé go gcuireann láithreacht quinone chealaithe bac ar chinneadh cruinn an tairiseach Michaelis dealraitheach (tá RC-LH114-W agus RC-LH116 oiriúnach do 0.2±0.1μM agus 0.5±0.2μM, faoi seach), tá an ráta uasta de RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5% níos mó ná RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Ar dtús mheasamar go bhfuil próitéin-W i láthair i thart ar 10% den choimpléasc croí (16); anseo, is iad na rátaí áitíochta cealla fáis íseal-sholais, meán-sholais, agus ard-sholais ná 15±0.6%, 11±1% agus 0.9±0.5, faoi seach % (Fíor 2F). Léirigh comparáid chainníochtúil ar mhais-speictriméadracht nár laghdaigh cur leis an gclib histidíne líonmhaireacht choibhneasta próitéin-W i gcomparáid le cineálacha fiáine (P = 0.59), mar sin ní déantán de phróitéin-W modhnaithe iad na leibhéil seo (Fíor S10). Mar sin féin, d'fhéadfadh an áitíocht íseal seo de phróitéin-W sa choimpléasc RC-LH1 ligean do roinnt RCanna casadh ar ráta luathaithe, rud a mhaolaíonn an malartú quinone/quinolone níos moille sa choimpléasc RC-LH116. Thugamar faoi deara nach bhfuil an ráta áitíochta ard-sholais comhsheasmhach leis na sonraí transcriptomics le déanaí, rud a léiríonn go méadaíonn léiriú géine pufW faoi sholas láidir (Fíor S11) (23). Tá an difríocht idir trascríobh pufW agus ionchorprú próitéine-W sa choimpléasc RC-LH1 mearbhall agus d'fhéadfadh sé rialáil chasta an phróitéine a léiriú.
I RC-LH114-W, leithdháiltear 6 mhóilín chairdiolipín (CDL), 7 fosfataidilchoilín (POPC), 1 fosfataidilgliocról (POPG) agus 29 β-DDM agus samhaltaítear ann 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG agus 12 βDDM. RC-LH116 (Fíor 5, A agus B). Sna dhá struchtúr seo, tá CDL suite beagnach ar thaobh an chíteaplasmaigh den choimpléasc, agus tá POPC, POPG agus β-DDM suite den chuid is mó ar an taobh luminal. Aonraíodh dhá mhóilín lipid agus glantach i réigiún αβ-1 go αβ-6 den choimpléasc RC-LH114-W (Fíor 5A), agus aonraíodh cúig cinn sa réigiún coibhéiseach de RC-LH116 (Fíor 5B). Fuarthas níos mó lipidí ar an taobh eile den choimpléasc, CDL den chuid is mó, carntha idir RC agus αβ-7 go αβ-13 (Fíor 5, A agus B). Tá lipidí agus glantaigh eile atá réitithe ó thaobh struchtúir de suite lasmuigh den fháinne LH1, agus síneann slabhraí aicile atá réitithe go maith idir fo-aonaid LH1, ar a dtugtar β-DDM go sealadach i RC-LH114-W, agus ar a shainmhínítear mar β-DDM i meascán RC de β-DDM agus POPC-LH116. Léiríonn na suíomhanna comhchosúla atá ag lipidí agus glantaigh chealaithe inár struchtúr gur láithreáin cheangailteach ábhartha ó thaobh na fiseolaíochta de iad (Fíor S12A). Tá comhsheasmhacht mhaith ag suíomhanna na móilíní coibhéiseacha i Tch freisin. Gentle agus Trv. Léirigh stráin 970 RC-LH1s (Fíor S12, B go E) (9, 12) agus iarmhair nasctha hidrigine an ghrúpa ceann lipid caomhnú sách maith san ailíniú seicheamhach (Fíor S13), rud a léiríonn go bhfuil CDL caomhnaithe a cheanglaíonn le RC (24), agus go bhféadfadh na suíomhanna seo a bheith caomhnaithe sa choimpléasc RC-LH1.
(A agus B) Léirítear peiptídí RC-LH114-W (A) agus RC-LH116 (B) le cartúin, agus léirítear na líocha le slata, ag baint úsáide as an scéim dathanna i bhFíor 1. Taispeántar lipidí i ndath dearg, agus taispeántar glantaigh i liath. Tá UQ ceangailte le láithreáin RC QA agus QB buí, agus tá UQ scoite gorm. (C agus D) Na radhairc chéanna le (A) agus (B), agus lipidí fágtha ar lár. (E go G) Radharc méadaithe de Q1(E), Q2(F) agus Q3(G) ó RC-LH116, le slabhraí taobh a mbíonn tionchar acu ar a chéile. Taispeántar na naisc hidrigine mar línte dubha poncaithe.
I RC-LH116, déantar RC QA agus QB UQ araon, a ghlacann páirt in aistriú leictreon sa phróiseas deighilte luchta, a dhíghrádú ina láithreáin cheangailteach. Mar sin féin, i RC-LH114-W, níl QB quinone réitithe agus pléifear go mion é thíos. Chomh maith le QA agus QB quinones, tá dhá mhóilín UQ cealaithe (suite idir na fáinní RC agus LH1) leithdháilte i struchtúr RC-LH114-W de réir a ngrúpaí ceann dea-réitithe (suite i Q1 agus Q2, faoi seach). spás). Fíor 5C). Tá dhá aonad isoprene sannta do Q1, agus réitíonn an léarscáil dlúis na 10 eireaball isoprene iomlána de Q2. I struchtúr RC-LH116, réitíodh trí mhóilín UQ10 cealaithe (Q1 go Q3, Fíor 5D), agus tá dlús soiléir ag na móilíní go léir ar fud an eireabaill (Fíor 5, D go G). Sa dá struchtúr, tá comhsheasmhacht den scoth ag suíomhanna na ngrúpaí ceann quinone de Q1 agus Q2 (Fíor S12F), agus ní idirghníomhaíonn siad ach le RC. Tá Q1 suite ag bealach isteach bhearna W RC-LH114-W (Fíor 1G agus 5, C, D agus E), agus tá Q2 suite gar don suíomh ceangailteach QB (Fíor 5, C, D) agus F). Tá na hiarmhair L-Trp143 agus L-Trp269 caomhnaithe an-ghar do Q1 agus Q2 agus soláthraíonn siad idirghníomhaíochtaí féideartha π-stacála (Fíor 5, E agus F, agus Fíor S12). Soláthraíonn L-Gln88, 3.0 Å ón ocsaigin distal de Q1, nasc láidir hidrigine (Fíor 5E); tá an t-iarmhar seo caomhnaithe i ngach RC ach amháin an gaol is faide i gcéin (Fíor S13). Cuirtear L-Ser91 in ionad Thr go coimeádach i bhformhór na RCanna eile (Fíor S13), tá sé 3.8 Angstrom ón meitile ocsaigin de Q1, agus féadfaidh sé bannaí hidrigine laga a sholáthar (Fíor 5E). Ní ​​cosúil go bhfuil idirghníomhaíocht shonrach ag Q3, ach tá sé suite sa réigiún hidreafóbach idir an fho-aonad RC-M agus an fho-aonad LH1-α 5 go 6 (Fíor 5, D agus G). Tá Q1, Q2 agus Q3 nó quinóin chealaithe in aice láimhe réitithe freisin i Tch. Gentle, Trv. Strain 970 agus Blc. Léiríonn struchtúr na hirise (9, 10, 12) suíomh ceangailteach quinóin chúnta caomhnaithe sa choimpléasc RC-LH1 (Fíor S12G). Tá na cúig UQ dianscaoilte i RC-LH116 i gcomhréir mhaith leis an 5.8 ± 0.7 de gach coimpléasc a chinntear trí chrómatagrafaíocht leachtach ardfheidhmíochta (HPLC), agus tá na trí UQ dianscaoilte i RC-LH114-W níos ísle ná . Léiríonn an luach tomhaiste de 6.2 ± 0.3 (Fíor S14) go bhfuil móilíní UQ neamhréitithe sa struchtúr.
Tá cúig TMH i ngach ceann de na polaipeiptídí L agus M bréagshiméadracha agus cruthaíonn siad heitreadiméir a chomhcheanglaíonn diméir BChl amháin, dhá mhonaiméir BChl, dhá mhonaiméir bhaictéarafagaigh (BPh), agus iarann ​​neamh-Heme amháin agus móilín nó dhó UQ10. Trí láithreacht bannaí hidrigine ar an ngrúpa céatóin críochfoirt agus a charnadh aitheanta i Rps, ionchorpraítear carotenoidí san fho-aonad M, ar a dtugtar cis-3,4-dehydroorhodopin. Speiceas (25). Tá fearann ​​​​membrane seachtrach RC-H ancaire leis an membrane ag TMH aonair. Tá an struchtúr RC foriomlán cosúil leis an trí fho-aonad RC de speicis ghaolmhara (mar shampla Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Forluíonn macra-thimthriallta BChl agus BPh, an cnámh droma carotenoid agus an t-iarann ​​​​neamh-heme laistigh de raon réitigh na struchtúr seo, mar a dhéanann an grúpa ceann UQ10 ag an suíomh QA agus an quinone QB ag RC-LH116 (Fíor S15).
Tugann infhaighteacht dhá struchtúr RC le rátaí áitíochta láithreáin QB éagsúla deis nua chun na hathruithe comhréire comhsheasmhacha a ghabhann le ceangal quinone QB a scrúdú. Sa choimpléasc RC-LH116, tá quinone QB suite sa suíomh "príomhach" atá ceangailte go hiomlán (26), ach níl quinone QB ag scaradh RC-LH114-W. Níl aon quinone QB i RC-LH114-W, rud atá ionadh mar go bhfuil an coimpléasc gníomhach, níos mó ná an coimpléasc RC-LH116 le quinone QB atá réitithe go struchtúrach. Cé go gceilíonn an dá fháinne LH1 thart ar shé quinone, tá cúig cinn réitithe go struchtúrach sa fáinne RC-LH116 dúnta, agus níl ach trí cinn teoranta go struchtúrach sa fáinne RC-LH114-W oscailte. D’fhéadfadh an neamhord struchtúrach méadaithe seo a léiriú go bhfuil athsholáthar níos tapúla ar láithreáin QB RC-LH114-W, cinéitic quinone níos tapúla sa choimpléasc, agus dóchúlacht mhéadaithe trasnú lúb LH1 ann. Molaimid gur toradh ar choimpléasc níos casta agus níos gníomhaí atá easpa UQ i suíomh RC QB RC-LH114-W, agus gur reoite láithreach suíomh QB RC-LH114-W i láimhdeachas UQ. Léiríonn an chéim shonrach (tá an bealach isteach chuig suíomh QB dúnta) comhréireacht na gníomhaíochta seo.
Gan QB, rothlaíonn L-Phe217 go suíomh nach bhfuil comhoiriúnach le ceangal UQ10, mar go mbeidh imbhualadh spásúil leis an gcéad aonad isoprene den eireaball mar thoradh air (Fíor 6A). Ina theannta sin, tá na príomhathruithe comhréire soiléire, go háirithe an héilics de (héilics ghearr sa lúb idir TMH D agus E) áit a n-aistrítear L-Phe217 go dtí an póca ceangailteach QB agus rothlú L-Tyr223 (Fíor 6A) chun an nasc hidrigine leis an gcreat M-Asp45 a bhriseadh agus bealach isteach an tsuímh cheangailteach QB a dhúnadh (Fíor 6B). Casann an héilics de ag a bhun, aistrítear Cα L-Ser209 faoi 0.33 Å, agus aistrítear L-Val221Cα faoi 3.52 Å. Níl aon athruithe inbhraite i TMH D agus E, atá forshuite sa dá struchtúr (Fíor 6A). Chomh fada agus is eol dúinn, seo an chéad struchtúr sa RC nádúrtha a dhúnann an suíomh QB. Léiríonn comparáid leis an struchtúr iomlán (ceangailte le QB) go bhfuil athrú comhréireach ag teastáil sula laghdaítear an quinone chun go n-imeoidh sé isteach sa quinone. Rothlaíonn L-Phe217 chun idirghníomhaíocht π-chruachta a fhoirmiú leis an ngrúpa ceann quinone, agus bogann an héilics amach, rud a ligeann do chnámharlach L-Gly222 agus slabhra taobh L-Tyr223 líonra bannaí hidrigine a fhoirmiú le struchtúr bannaí hidrigine cobhsaí (Fíor 6, A agus C).
(A) Cartún forluiteach de struchtúr hologram (slabhra L, slabhra oráiste/slabhra M, magenta) agus apo (liath), ina bhfuil na hiarmhair phríomha le feiceáil i bhfoirm léiriú slat-chruthach. Léirítear UQ10 le barra buí. Léiríonn an líne phoncaithe na naisc hidrigine atá foirmithe sa struchtúr iomlán. (B agus C) Léiriú dromchla an apolipoprotein agus an struchtúir fáinne iomlán, ag béimniú ocsaigin slabhra taobh L-Phe217 i ngorm agus L-Tyr223 i ndearg, faoi seach. Tá an fho-aonad L oráiste; níl na fo-aonaid M agus H daite. (D agus E) Láithreáin apolipoprotein (D) agus iomlána (E) RC QB [dathú de réir (A) faoi seach] agus Thermophilus thermophilus PSII (glas, gorm le quinone plaisteach; PDB ID: 3WU2) Ailínigh (58).
Gan choinne, cé go bhfuil roinnt struchtúr de RCanna easnamhach QB gan LH1 ar fáil, níor tuairiscíodh na hathruithe comhréire a breathnaíodh sa staidéar seo roimhe seo. Áirítear leis seo struchtúr ídithe QB ó Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) agus Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), agus tá siad go léir beagnach mar an gcéanna lena struchtúr QB foriomlán. Léirigh scrúdú géar ar 3PRC go gceanglaíonn móilíní glantach LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ag bealach isteach shuíomh QB, rud a d'fhéadfadh cosc ​​a chur ar athchóiriú i gcomhréireacht dúnta. Cé nach ndíscaoileann LDAO ag an suíomh céanna in 1EYS ná 1OGV, ullmhaítear na RCanna seo ag baint úsáide as an nglantach céanna agus dá bhrí sin féadfaidh siad an éifeacht chéanna a tháirgeadh. Struchtúr criostail Rba. Is cosúil go bhfuil suíomh QB dúnta ag Sphaeroides RC atá comhchriostalaithe le cíteacróim c2 (PDB ID: 1L9B). Mar sin féin, sa chás seo, glacann réigiún N-críochfoirt an pholaipeiptíde RC-M (ag idirghníomhú leis an suíomh ceangailteach QB tríd an nasc H den iarmhar Tyr ar an héilics Q) comhréireacht mhínádúrtha, agus ní dhéantar iniúchadh breise ar an athrú comhréireachta QB (30). Is rud dearfach é ná nach bhfacamar an cineál seo dífhoirmithe ar an pholaipeiptíd M i struchtúr RC-LH114-W, atá beagnach mar an gcéanna leis an réigiún N-críochfoirt de RC-LH116 RC. Ba chóir a thabhairt faoi deara freisin, tar éis deireadh a chur leis an aeróg LH1 bunaithe ar ghlantach, gur réitíodh na RCanna apolipoprotein sa PDB, rud a chuir deireadh leis na linnte quinone inmheánacha agus na lipidí sa bhearna idir an RC agus dromchla istigh an fháinne LH1 máguaird (31, 32). Fanann RC feidhmiúil mar go gcoinníonn sé na comhfhachtóirí go léir, seachas an quinone QB in-dhíghrádaithe, atá níos lú cobhsaí agus a chailltear go minic le linn an phróisis ullmhúcháin (33). Ina theannta sin, is eol gur féidir le baint LH1 agus lipidí timthriallacha nádúrtha ó RC tionchar a imirt ar fheidhmeanna, amhail saolré giorraithe an stáit P+QB scartha ó lucht (31, 34, 35). Dá bhrí sin, táimid ag tuairimíocht go bhféadfadh láithreacht an fháinne LH1 áitiúil timpeall an RC an suíomh QB “dúnta” a choinneáil, rud a chaomhnaíonn an timpeallacht áitiúil in aice leis an QB.
Cé nach léiríonn apolipoprotein (gan QB quinone) agus an struchtúr iomlán ach dhá shnap den athrú ar shuíomh QB, seachas sraith imeachtaí, tá comharthaí ann gur féidir an ceangal a gheatú chun athcheangal ag hidreacuinón a chosc chun cosc ​​a chur ar chosc foshraithe. D’fhéadfadh idirghníomhaíocht quinolol agus quinone in aice le suíomh QB apolipoprotein a bheith difriúil, rud a fhágann go ndiúltaíonn RC dó. Tá sé molta le fada go bhfuil ról ag athruithe comhréire i gceangal agus laghdú quinones. Tá lagú ar chumas RCanna reoite quinones a laghdú tar éis oiriúnú dorcha (36); léiríonn criostalagrafaíocht X-ghathach gur mar gheall ar quinones QB atá gafa i gcomhréireacht “distal” thart ar 4.5 Å ón suíomh gníomhach proximal (26), 37 atá an damáiste seo. Molaimid gurb é an chomhréireacht cheangailteach distal seo ná pictiúr den staid idirmheánach idir apolipoprotein agus an struchtúr fáinne iomlán, a leanann an t-idirghníomhaíocht tosaigh le quinone agus oscailt shuíomh QB.
Tá caomhnú struchtúrach agus feidhmiúil ag an RC cineál II a fhaightear i gcoimpléasc PSII baictéir fhótatrófacha áirithe agus cianobacteria, algaí agus plandaí (38). Leagann an ailíniú struchtúrach a thaispeántar i bhFíor 6 (D agus E) béim ar an gcosúlacht idir RCanna PSII agus suíomh QB an choimpléasc RC baictéaraigh. Is samhail le fada an lá an chomparáid seo chun staidéar a dhéanamh ar na córais ghaolmhara ceangail agus laghdaithe quinone. Mhol foilseacháin roimhe seo go bhfuil laghdú PSII ar quinones ag gabháil le hathruithe comhréire (39, 40). Dá bhrí sin, agus caomhnú éabhlóideach RC á bhreithniú, d'fhéadfadh an mheicníocht cheangailteach neamhbhraite seo a bheith infheidhme freisin maidir le suíomh QB PSII RC i bplandaí fótatrófacha ocsaiginithe.
Sraitheanna Rps ΔpufW (scriosadh pufW gan lipéad) agus PufW-His (próitéin-W clibáilte C-críochfoirt 10x a léirítear ón lócas pufW nádúrtha). Rinneadh cur síos ar palustris CGA009 inár saothar roimhe seo (16). Aisghabhadh na sraitheanna seo agus an tuismitheoir cineál fiáin isóigineach ón reoiteoir trí líon beag cealla a stríocadh ar phláta PYE (gach ceann 5 g lítear -1) (stóráilte i LB ag -80 °C, ina bhfuil 50% (w/v) gliocról) próitéin, eastósc giosta agus succinate) agar [1.5% (w/v)]. Goradh an pláta thar oíche sa dorchadas ag teocht an tseomra faoi choinníollacha anaeróbacha, agus ansin soilsiú le solas bán (~50 μmolm-2 s-1) arna sholáthar ag bolgáin halaigine OSRAM 116-W (RS Components, RA) ar feadh 3 go 5 lá go dtí gur tháinig coilíneacht aonair chun cinn. Baineadh úsáid as coilíneacht aonair chun 10 ml de mheán M22+ (41) a ionaclú, agus 0.1% (m/v) casaimínaigéid curtha leis (dá ngairtear M22 anseo feasta). Fásadh an cultúr faoi choinníollacha íseal-ocsaigine sa dorchadas ag 34°C agus é á chroitheadh ​​ag 180 rpm ar feadh 48 uair an chloig, agus ansin ionaclúdh 70 ml den chultúr faoi na coinníollacha céanna ar feadh 24 uair an chloig. Úsáidtear cultúr leath-aeróbach le toirt 1 ml chun 30 ml de mheán M22 a ionaclú i mbotella gloine trédhearcach le barr scriú uilíoch 30 ml agus é a ionradaíocht le corraíl (~50μmolm-2 s-1) ar feadh 48 uair an chloig le slat corraithe steiriúil le fórsa maighnéadach. Ansin ionaclúdh 30 ml den chultúr le thart ar 1 lítear de chultúr faoi na coinníollacha céanna, agus úsáideadh an cultúr sin ansin chun thart ar 9 lítear de chultúr a ionaclú, a bhí soilsithe ag ~200 μmolm-2 s-1 ar feadh 72 uair an chloig. Bailíodh na cealla trí lártheifneoiriú ag 7132 RCF ar feadh 30 nóiméad, athfhionraíodh iad i ~10 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8.0), agus stóráladh iad ag -20°C go dtí go mbeadh gá leo.
Tar éis leá, cuir roinnt criostail de dhí-ocsairibonúicléáis I (Merck, an Ríocht Aontaithe), lysisím (Merck, an Ríocht Aontaithe) agus dhá tháibléad Roche coscaire próitéáis holoenzyme (Merck, an Ríocht Aontaithe) leis na cealla athfhionraí. I gcill brú Francach 20,000 psi (Aminco, SAM), briseadh na cealla 8 go 12 uair. Tar éis cealla neamhbhriste agus smionagar dothuaslagtha a bhaint trí lártheifneoiriú ag 18,500 RCF ar feadh 15 nóiméad ag 4°C, deascadh an scannán ón lysáit líocha trí lártheifneoiriú ag 113,000 RCF ar feadh 2 uair an chloig ag 43,000°C. Caith an codán intuaslagtha agus athfhionraí an scannán daite i 100 go 200 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8.0) agus homaiginigh go dtí nach bhfuil aon chomhiomláin le feiceáil. Goradh an scannán ar fionraí i 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, SAM) ina raibh 2% (m/v) β-DDM ar feadh 1 uair an chloig sa dorchadas ag 4°C agus é á mheascadh go réidh. Ansin, lártheifneoirigh é ag 70°C chun 150,000 RCF a thuaslagadh ag 4°C ar feadh 1 uair an chloig chun aon iarmhar dothuaslagtha a bhaint.
Cuireadh an scannán intuaslagtha ón strain ΔpufW i bhfeidhm ar cholún malartaithe ian DEAE Sepharose 50 ml le trí thoirt cholúin (CV) de mhaolán ceangailteach [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ina raibh 0.03% (m / v) β-DDM]. Nigh an colún le dhá mhaolán ceangailteach CV, agus ansin nigh an colún le dhá mhaolán ceangailteach ina raibh 50 mM NaCl. Ealúdaíodh an coimpléasc RC-LH116 le grádán líneach de 150 go 300 mM NaCl (i maolán ceangailteach) ar 1.75 CV, agus ealúdaíodh an coimpléasc ceangailteach atá fágtha le maolán ceangailteach ina raibh 300 mM NaCl ar 0.5 CV. Bailigh an speictream ionsúcháin idir 250 agus 1000 nm, coinnigh an codán a bhfuil cóimheas ionsúcháin (A880/A280) níos mó ná 1 aige ag 880 go 280 nm, caolaigh faoi dhó é sa mhaolán ceangailteach, agus bain úsáid as an nós imeachta céanna arís ar an gcolún DEAE Ar íonú. Caolaigh na codáin a bhfuil cóimheasa A880/A280 níos airde ná 1.7 agus cóimheasa A880/A805 níos airde ná 3.0 acu, déan an tríú babhta de mhalartú ian, agus coinnigh codáin a bhfuil cóimheasa A880/A280 níos airde ná 2.2 agus cóimheasa A880/A805 níos airde ná 5.0 acu. Comhchruinníodh an coimpléasc páirteach-íonaithe go dtí ~2 ml i scagaire lártheifeacha Amicon 100,000 le haghaidh scor-mheáchan móilíneach (MWCO) (Merck, an Ríocht Aontaithe), agus luchtáladh é ar cholún eisiaimh méide Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, SAM) ina raibh maolán NaCl 200 mM, agus ansin eiscíodh sa mhaolán céanna é ag 1.5 CV. Bailigh na speictrim ionsúcháin den chodán eisiaimh méide, agus comhchruinnigh na speictrim ionsúcháin le cóimheasa A880/A280 os cionn 2.4 agus cóimheasa A880/A805 os cionn 5.8 go 100 A880, agus bain úsáid astu láithreach le haghaidh ullmhúcháin nó stórála eangach crio-TEM. Coinnigh ag -80°C go dtí go mbeidh gá leo.
Cuireadh an scannán intuaslagtha ó shliocht PufW-His i bhfeidhm ar cholún 20 ml de HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ina raibh 200 mM NaCl agus 0.03% (m/m)) i maolán IMAC (GE Healthcare). (v) β-DDM]. Níodh an colún le cúig CV de mhaolán IMAC, agus ansin le cúig CV de mhaolán IMAC ina raibh 10 mM histidín. Scaoileadh an coimpléasc croí ón gcolún le cúig mhaolán IMAC ina raibh 100 mM histidín. Déantar an codán ina bhfuil an coimpléasc RC-LH114-W a chomhchruinniú go ~10 ml in umar corraithe atá feistithe le scagaire Amicon 100,000 MWCO (Merck, an Ríocht Aontaithe), caolaítear 20 uair é le maolán ceangailteach, agus ansin cuirtear le 25 ml é. Sa cholún DEAE Sepharose, úsáidtear ceithre CV atá ceangailte leis an maolán roimh ré. Nigh an colún le ceithre mhaolán ceangailteach CV, ansin eisil an coimpléasc ar ocht CV ar ghrádán líneach de 0 go 100 mM NaCl (i maolán ceangailteach), agus na ceithre CV eile ina bhfuil maolán ceangailteach 100 mM. Rinneadh na coimpléisc iarmharacha a eisilíodh ar an gclóiríd sóidiam in éineacht leis an gcóimheas A880/A280 níos airde ná 2.4 agus an cóimheas A880/A805 níos airde ná 4.6 a dhíriú go ~2 ml i scagaire lártheifeacha Amicon 100,000 MWCO, agus líonadh é le 1.5 CV IMAC roimh ré. Colún eisiaimh méide Superdex 200 16/600 atá cothromaithe le maolán, agus ansin eisilíodh sa mhaolán céanna thar 1.5 CV. Bailigh na speictrim ionsúcháin de na codáin eisiaimh méide agus comhchruinnigh na speictrim ionsúcháin le cóimheasa A880/A280 os cionn 2.1 agus cóimheasa A880/A805 os cionn 4.6 go 100 A880, a úsáidtear láithreach le haghaidh ullmhúcháin eangach TEM reoite nó a stóráiltear ag -80°C go dtí go mbeidh gá leo.
Baineadh úsáid as reoiteoir tumoideachais Leica EM GP chun eangacha TEM ísealteochta a ullmhú. Caolaíodh an coimpléasc i maolán IMAC go A880 de 50, agus ansin luchtaíodh 5μl ar mhogalra copair brataithe le carbóin QUANTIFOIL 1.2/1.3 a bhí scaoilte le lonrán le déanaí (Agar Scientific, an Ríocht Aontaithe). Gor an eangach ag 20°C agus 60% taiseachas coibhneasta ar feadh 30 soicind, ansin déan í a thriomú go réidh ar feadh 3 soicind, agus ansin múch í in eatán leachtach ag -176°C.
Taifeadadh sonraí an choimpléasc RC-LH114-W ar an eBIC (Ionad Bithíomháithe Leictreonach) (British Diamond Light Source) le micreascóp Titan Krios, a oibríonn ag voltas luasghéaraithe 300kV, le formhéadú ainmniúil 130,000× agus fuinneamh - Roghnaigh bearna 20 eV. Baineadh úsáid as Gatan 968 GIF Quantum le brathadóir buaic K2 chun íomhánna a thaifeadadh i mód comhairimh chun sonraí a bhailiú. Is é 1.048 Å an méid picteilín calabraithe, agus is é 3.83 e-Å-2s-1 an ráta dáileoige. Bailíodh an scannán i 11 soicind agus roinneadh ina 40 cuid é. Baineadh úsáid as an limistéar atá brataithe le carbón chun an micreascóp a athfhócasú, agus ansin bailíodh trí scannán in aghaidh an phoill. San iomlán, bailíodh 3130 scannán, le luachanna dífhócasaithe idir -1 agus -3μm.
Bailíodh na sonraí don choimpléasc RC-LH116 ag baint úsáide as an micreascóp céanna ag Saotharlann Bithstruchtúir Asterbury (Ollscoil Leeds, an Ríocht Aontaithe). Bailíodh na sonraí i mód comhairimh le formhéadú 130 k, agus calabraíodh méid na bpicteilíní go 1.065 Å le dáileog de 4.6 e-Å-2s-1. Taifeadadh an scannán i 12 soicind agus roinneadh ina 48 cuid é. San iomlán, bailíodh 3359 scannán, le luachanna dífhócais idir -1 agus -3μm.
Déantar an phróiseáil sonraí go léir i bpíblíne Relion 3.0 (42). Bain úsáid as Motioncorr 2 (43) chun gluaiseacht an bhíoma a cheartú trí mheá dáileoige, agus ansin bain úsáid as CTFFIND 4.1 (44) chun an paraiméadar CTF (feidhm aistrithe codarsnachta) a chinneadh. Taispeántar fóta-mhicreagraif tipiciúla tar éis na gcéimeanna próiseála tosaigh seo i bhFíor 2. S16. Gintear an teimpléad roghnúcháin uathoibríoch trí thart ar 250 picteilín de 1000 cáithnín a roghnú de láimh i bhfráma 250 picteilín agus gan aon aicmiú tagartha dháthoiseach (2T), rud a dhiúltaíonn na haicmithe sin a chomhlíonann éilliú samplach nó nach bhfuil aon tréithe inaitheanta acu. Ansin, rinneadh roghnú uathoibríoch ar na micreaghrafanna go léir, agus bhí 849,359 cáithnín sa RC-LH114-W, agus bhí 476,547 cáithnín sa choimpléasc RC-LH116. Tá dhá bhabhta d'aicmiú 2T neamh-thagairteach déanta ar na cáithníní roghnaithe go léir, agus tar éis gach rith, diúltaítear do na cáithníní a chomhlíonann an limistéar carbóin, éilliú an tsampla, gan aon ghnéithe soiléire nó cáithníní a bhfuil forluí láidir acu, rud a fhágann 772,033 (90.9%) agus 359,678 (75.5%). Úsáidtear cáithníní le haghaidh aicmiú 3T ar RC-LH114-W agus RC-LH116 faoi seach. Gineadh an chéad mhúnla tagartha 3T ag baint úsáide as an modh íslithe grádáin stocastaigh. Ag baint úsáide as an tsamhail tosaigh mar thagairt, aicmítear na cáithníní roghnaithe i gceithre chatagóir i 3T. Ag baint úsáide as an tsamhail sa chatagóir seo mar thagairt, déan scagadh 3T ar na cáithníní sa chatagóir is mó, ansin bain úsáid as an scagaire íseal-phas 15Å tosaigh chun an limistéar tuaslagóra a chlúdach, cuir 6 phicteil d'imeall bog leis, agus déan iar-phróiseáil ar na picteilíní chun feidhm aistrithe Modhnú buaic Gatan K2 an bhraiteora barr a cheartú. I gcás an tacair sonraí RC-LH114-W, rinneadh an tsamhail tosaigh seo a mhodhnú tríd an dlús láidir a bhaint ag imill an masc (dícheangailte ón dlús casta croí i gCiméara UCSF). Úsáidtear na samhlacha a eascraíonn as (is iad 3.91 agus 4.16 Å taifeach RC-LH114-W agus RC-LH116, faoi seach) mar thagairt don dara babhta d'aicmiú 3T. Déantar na cáithníní a úsáidtear a ghrúpáil sa rang 3T tosaigh agus níl aon chomhghaol láidir acu leis an gcomharsanacht. Forluí nó easpa gnéithe struchtúracha soiléire. Tar éis an dara babhta d'aicmiú 3T, roghnaíodh an chatagóir leis an taifeach is airde [I gcás RC-LH114-W, is é 377,703 cáithnín (44.5%) catagóir amháin, i gcás RC-LH116, tá dhá chatagóir ann, ina bhfuil 260,752 cáithnín san iomlán (54.7%), áit a bhfuil siad mar an gcéanna ach amháin nuair a ailínítear iad tar éis an rothlaithe tosaigh le difríocht bheag]. Déantar na cáithníní roghnaithe a ath-eastóscadh i mbosca 400 picteilín agus a scagadh trí scagadh 3T. Gintear an masc tuaslagóra ag baint úsáide as an scagaire íseal-phas 15Å tosaigh, leathnú léarscáile 3 picteilín agus masc bog 3 picteilín. Ag baint úsáide as scagadh CTF in aghaidh an cháithnín, ceartú gluaiseachta in aghaidh an cháithnín agus an dara babhta de scagadh CTF in aghaidh an cháithnín, déantar scagadh 3T, masc tuaslagóra agus iarphróiseáil i ndiaidh gach céim chun an uigeacht mar thoradh air sin a scagadh tuilleadh. Ag baint úsáide as luach scoite FSC (Comhéifeacht Comhghaoil ​​​​Fourier Shell) de 0.143, is iad taifeach na samhlacha deiridh de RC-LH114-W agus RC-LH116 ná 2.65 agus 2.80 Å, faoi seach. Taispeántar cuar FSC an mhúnla deiridh i bhFíor 2. S17.
Íoslódáladh na seichimh próitéine go léir ó UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Baineadh úsáid as SWISS-MODEL (45) chun samhail homalógachta de RC a thógáil, ina bhfuil seichimh próitéine RC-L, RC-M agus RC-H agus struchtúr criostail Rba. Baineadh úsáid as sphaeroides RC mar theimpléad (PDB ID: 5LSE) (46). Bain úsáid as an uirlis “map fheistiú” i UCSF Chimera chun an tsamhail ghinte a fheistiú leis an léarscáil (47), feabhas a chur ar struchtúr na próitéine, agus bain úsáid as Coot (48) chun an comhfhachtóir [4×BChl a (ainm iarmhair leabharlainne monaiméirí = BCL), 2×BPh a (BPH), cineál amháin nó dhó de UQ10 (U10), iarann ​​neamh-héime amháin (Fe) agus 3,4-déhidreheicsacarbóinilcholine amháin (QAK)] a chur leis. Ós rud é nach bhfuil QAK ar fáil sa leabharlann monaiméirí, rinneadh paraiméadair air ag baint úsáide as an uirlis eLBOW i PHENIX (49).
Ansin, tógadh an fo-aonad LH1. Ar dtús, úsáideadh an uirlis tógála uathoibríoch i PHENIX (49) chun cuid den seicheamh LH1 a thógáil go huathoibríoch ag baint úsáide as an léarscáil agus na seichimh próitéine LH1-α agus LH1-β mar ionchur. Roghnaigh an fo-aonad LH1 is iomláine, bain é agus luchtaigh isteach i Coot é, cuir an seicheamh atá ar iarraidh leis de láimh, agus scag an struchtúr iomlán de láimh sula gcuirtear dhá BCls a (BCL) agus spirilloxanthin (CRT) leis [de réir an Rps ábhartha Dlús an choimpléasc LH1 agus an t-ábhar caratinoid ar a dtugtar. Speiceas (17)]. Cóipeáil an fo-aonad LH1 iomlán, agus bain úsáid as “Uirlis Léarscáile Dugaireachta” UCSF Chimera chun dugaireacht a dhéanamh sa limistéar neamh-mhúnlaithe in aice láimhe de dhlús LH1, agus ansin scag é i Coot; déan an próiseas arís go dtí go mbeidh gach fo-aonad LH1 samhaltaithe. I gcás struchtúr RC-LH114-W, tríd an dlús neamhleithdháilte a bhaint amach sa Coot, déantar an próitéin a dheighilt ó na comhpháirteanna neamhphróitéine atá fágtha i léarscáil Chimera USCF agus úsáidtear an uirlis Autobuild chun an tsamhail tosaigh, agus na fo-aonaid atá fágtha (próitéin-W) a bhunú. Samhaltú. I PHENIX (49). Cuir aon seichimh atá ar iarraidh leis an tsamhail mar thoradh air i Coot (48), agus ansin scag an fo-aonad iomlán de láimh. Oireann an dlús neamhleithdháilte atá fágtha don teaglaim de lipidí (ID leabharlann monaiméir PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL agus POPG = PGT), glantach β-DDM (LMT) agus móilíní UQ10 (U10). Bain úsáid as uasmhéadú PHENIX (49) agus uasmhéadú láimhe i Coot (48) chun an tsamhail tosaigh iomlán a fheabhsú go dtí nach féidir feabhas a chur ar staitisticí an tsamhail agus ar cháilíocht amhairc an oiriúnaithe a thuilleadh. Ar deireadh, bain úsáid as LocScale (50) chun an léarscáil áitiúil a ghéarú, agus ansin déan roinnt timthriallta eile de shamhaltú an dlúis neamhleithdháilte agus uasmhéadú uathoibríoch agus láimhe.
Taispeántar na peiptídí, na comhfhachtóirí agus na lipidí agus na cuinóin eile faoi seach atá ceangailte dá ndlúis faoi seach i bhFíor 1 agus 2. S18 go S23. Taispeántar an fhaisnéis staitistiúil faoin tsamhail deiridh i dTábla S1.
Mura sonraítear a mhalairt, bailíodh na speictrim ionsúcháin UV/Vis/NIR ar speictreafótaiméadar Cary60 (Agilent, SAM) ag eatraimh 1 nm ó 250 nm go 1000 nm agus am comhtháthaithe de 0.1s.
Caolaigh an sampla i gcuvette grianchloiche le cosán 2 mm go A880 de 1, agus bailigh an speictream ionsúcháin idir 400 agus 1000 nm. Bailíodh na speictrim déchróiceacha ciorclacha ar speictreapolairiméadar Jasco 810 (Jasco, an tSeapáin) ag eatraimh 1 nm idir 400 nm agus 950 nm ag ráta scanadh de 20 nm nóim-1.
Cinntear an chomhéifeacht múchta mólar tríd an gcoimpléasc croí a chaolú go A880 de thart ar 50. Caolaigh an toirt 10μl i maolán ceangailteach 990μl nó meatánól, agus bailigh an speictream ionsúcháin láithreach chun díghrádú BChl a íoslaghdú. Ríomhadh cion BChl gach sampla meatánóil tríd an gcomhéifeacht múchta ag 771 nm de 54.8 mM-1 cm-1, agus cinneadh an chomhéifeacht múchta (51). Roinn an tiúchan BChl tomhaiste faoi 32 (RC-LH114-W) nó 36 (RC-LH116) chun tiúchan an choimpléasc chroí a chinneadh, a úsáidtear ansin chun speictream ionsúcháin an tsampla chéanna a bailíodh sa mhaolán comhthreomhar a chinneadh. Tógadh trí thomhas arís agus arís eile do gach sampla, agus úsáideadh meán-ionsú an uasmhéid BChl Qy le haghaidh ríomha. Is é 3280±140 mM-1 cm-1 comhéifeacht múchta RC-LH114-W arna thomhas ag 878 nm, agus is é 3800±30 mM-1 cm-1 comhéifeacht múchta RC-LH116 arna thomhas ag 880 nm.
Rinneadh UQ10 a chainníochtú de réir na modhe i (52). Go hachomair, rinneadh HPLC céim droim ar ais (RP-HPLC) ag baint úsáide as córas Agilent 1200 HPLC. Tuaslaig thart ar 0.02 nmol de RC-LH116 nó RC-LH114-W i 50μl de 50:50 meatánól:clóraform ina bhfuil 0.02% (m/v) clóiríd fheireach, agus instealladh an Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm réamhchothromaithe Tuaslag i 1 ml-1 nóim-1 ag 40°C i dtuaslagán HPLC (80:20 meatánól:2-própanól) ar cholún ×25 cm. Déan elution isocratach i dtuaslagán HPLC chun monatóireacht a dhéanamh ar an ionsú ag 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoidí) agus 780 nm (BChl) ar feadh 1 uair an chloig. Comhtháthaíodh an buaic sa chrómatagram 275 nm ag 25.5 nóiméad, agus ní raibh aon chomhdhúile eile inbhraite ann. Úsáidtear an limistéar comhtháite chun an méid mólar de UQ10 a eastóscadh a ríomh agus tagairt á déanamh don chuar calabrúcháin a ríomhadh ó instealladh caighdeán íon ó 0 go 5.8 nmol (Fíor S14). Rinneadh anailís ar gach sampla i dtrí mhacasamhlú, agus comhfhreagraíonn an earráid a tuairiscíodh do SD an mheáin.
Ullmhaíodh tuaslagán ina raibh an coimpléasc RC-LH1 le huas-ionsú Qy de 0.1 le 30 μM de chíteacróim c2 croí capaill laghdaithe (Merck, an Ríocht Aontaithe) agus 0 go 50 μMUQ2 (Merck, an Ríocht Aontaithe). Ullmhaíodh trí shampla 1-ml ag gach tiúchan UQ2 agus goradh iad thar oíche sa dorchadas ag 4°C chun oiriúnú iomlán don dorchadas a chinntiú roimh an tomhas. Luchtaíodh an tuaslagán i speictreafótaiméadar modúlach OLIS RSM1000 atá feistithe le grátáil lasair/líne 500 nm 300 nm, ionraon 1.24 mm, lár 0.12 mm agus scoilteanna asraon 0.6 mm. Cuirtear scagaire pas 600 nm ar fhad ag bealach isteach an fheadáin fhóta-iolraitheora samplach agus an fheadáin fhóta-iolraitheora tagartha chun solas spreagtha a eisiamh. Rinneadh monatóireacht ar an ionsú ag 550 nm le ham comhtháthaithe de 0.15 s. Astaítear an solas spreagtha ón LED 880 nm M880F2 (Dé-óid Astaithe Solais) (Thorlabs Ltd., RA) trí chábla snáthoptaice ag déine 90% trí rialtóir DC2200 (Thorlabs Ltd., RA) agus astaítear chuig an bhfoinse solais é ag uillinn 90°. Tá an bhíoma tomhais i gcoinne an scátháin chun aon solas nár ionsúigh an sampla ar dtús a thabhairt ar ais. Déan monatóireacht ar an ionsú ar feadh 10 soicind roimh an soilsiú de 50 soicind. Ansin rinneadh monatóireacht bhreise ar an ionsú ar feadh 60 soicind sa dorchadas chun a mheas cé chomh mór agus a laghdaíonn quinolol cíteacróim c23+ go spontáineach (féach Fíor S8 le haghaidh sonraí amha).
Rinneadh na sonraí a phróiseáil trí ráta tosaigh líneach a fheistiú laistigh de 0.5 go 10 soicind (ag brath ar thiúchan UQ2) agus meánrátaí na dtrí shampla ag gach tiúchan UQ2 a ríomh. Baineadh úsáid as an tiúchan RC-LH1 a ríomhadh leis an gcomhéifeacht múchta faoi seach chun an ráta a thiontú ina éifeachtúlacht chatalaíoch, a plotaíodh in Origin Pro 2019 (OriginLab, SAM), agus a fheistiú leis an tsamhail Michaelis-Menten chun na luachanna dealraitheacha Km agus Kcat a chinneadh.
Chun tomhais ionsúcháin neamhbhuana a dhéanamh, caolaíodh an sampla RC-LH1 go ~2μM i maolán IMAC ina raibh 50 mM ascorbáit sóidiam (Merck, SAM) agus 0.4 mM Terbutin (Merck, SAM). Úsáidtear aigéad ascorbach mar dheontóir leictreon íobairteach, agus úsáidtear tert-bútaclófen mar choscóir QB chun a chinntiú go bhfanann an príomhdheontóir RC laghdaithe (is é sin, gan a bheith fóta-ocsaídithe) i rith an phróisis tomhais. Cuirtear thart ar 3 ml den sampla le cill rothlach saincheaptha (thart ar 0.1 m ar trastomhas, 350 RPM) le fad cosáin optúil 2 mm chun a chinntiú go bhfuil dóthain ama ag an sampla sa chonair léasair le haghaidh oiriúnú dorcha idir bíoga spreagtha. Bain úsáid as bíoga léasair ~100-fs chun an córas léasair Ti: Sapphire (Spectra Physics, SAM) a aimpliú chun an sampla a spreagadh ag 880 nm ag ráta athrá 1 kHz (20 nJ do NIR nó 100 nJ do Vis). Sula mbailítear sonraí, nochtaigh an sampla do sholas spreagtha ar feadh thart ar 30 nóiméad. Cuirfidh nochtadh faoi deara neamhghníomhachtú QA (b'fhéidir go laghdófar QA uair nó dhó). Ach tabhair faoi deara le do thoil go bhfuil an próiseas seo inchúlaithe mar tar éis tréimhse fada oiriúnaithe don dorchadas, fillfidh RC go mall ar ghníomhaíocht QA. Baineadh úsáid as speictriméadar Helios (Ultrafast Systems, SAM) chun speictrim neamhbhuana a thomhas le moill ama de -10 go 7000 ps. Bain úsáid as bogearraí Surface Xplorer (Ultrafast Systems, SAM) chun na tacair sonraí a dhíghrúpáil, ansin iad a chumasc agus a chaighdeánú. Bain úsáid as an bpacáiste bogearraí CarpetView (Light Conversion Ltd., an Liotuáin) chun an tacar sonraí comhcheangailte a úsáid chun speictrim difreálacha a bhaineann le meath a fháil, nó bain úsáid as feidhm a chomhcheanglaíonn il-easpónantáin le freagairt na hionstraime chun freastal ar an éabhlóid speictreach aon-thonnfhaid in Origin (OriginLab, SAM).
Mar a luadh thuas (53), ullmhaíodh scannán fótaisintéiseach ina raibh coimpléasc LH1 nach raibh antenna RC ná antenna imeallach LH2 ann. Caolaíodh an membrane i 20 mM tris (pH 8.0) agus ansin luchtaíodh i gcuvette grianchloiche é le cosán optúil 2 mm. Baineadh úsáid as cuisle léasair 30nJ chun an sampla a spreagadh ag 540 nm le moill ama de -10 go 7000 ps. Próiseáil an tacar sonraí mar a thuairiscítear don sampla Rps. pal.
Rinneadh millíní den scannán trí lártheifneoiriú ag 150,000 RCF ar feadh 2 uair an chloig ag 4°C, agus ansin athfhionraíodh a ionsú ag 880 nm i 20 mM tris-HCl (pH 8.0) agus 200 mM NaCl. Tuaslaig an scannán trína mheascadh go mall i 2% (m/v) β-DDM ar feadh 1 uair an chloig sa dorchadas ag 4°C. Caolaíodh an sampla i 100 mM tríeitileamóiniam carbónáit (pH 8.0) (TEAB; Merck, an Ríocht Aontaithe) go dtí tiúchan próitéine de 2.5 mg ml-1 (anailís Bio-Rad). Rinneadh tuilleadh próiseála ón modh a foilsíodh roimhe seo (54), ag tosú le caolú 50 μg próitéine i 50 μl TEAB san iomlán ina raibh 1% (m/v) laurate sóidiam (Merck, an Ríocht Aontaithe). Tar éis sonication ar feadh 60 soicind, laghdaíodh é le 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, an Ríocht Aontaithe) ag 37°C ar feadh 30 nóiméad. Chun S-ailciliú a dhéanamh, goradh an sampla le 10 mM meitile S-meitilthiomeatánsulfónáit (Merck, an Ríocht Aontaithe) agus cuir leis é ó thuaslagán stoic isopropanol 200 mM ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Rinneadh díleá próitéalaíoch trí 2 μg de mheascán trypsin/endopróitéináis Lys-C (Promega an Ríocht Aontaithe) a chur leis agus goradh ag 37°C ar feadh 3 uair an chloig. Baineadh an surfactant laurate trí 50 μl d'aicéatáit eitile agus 10 μl d'aigéad trífhluairaicéiteach grád LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, an Ríocht Aontaithe) a chur leis agus vortexing ar feadh 60 soicind. Cuireadh an scaradh céime chun cinn trí lártheifneoiriú ag 15,700 RCF ar feadh 5 nóiméad. De réir phrótacal an mhonaróra, úsáideadh colún sníomha C18 (Thermo Fisher Scientific, an Ríocht Aontaithe) chun an chéim íochtarach ina raibh an peiptíd a shú isteach agus a dhíshalannú go cúramach. Tar éis a thriomú trí lártheifneoiriú folúis, tuaslagadh an sampla i 0.5% TFA agus 3% aicéatóinítríl, agus rinneadh anailís ar 500 ng trí chrómatagrafaíocht nana-shreabhadh RP in éineacht le mais-speictriméadracht ag baint úsáide as na paraiméadair chórais a mionsonraíodh roimhe seo.
Bain úsáid as MaxQuant v.1.5.3.30 (56) chun próitéiní a aithint agus a chainníochtú agus cuardach a dhéanamh ar bhunachar sonraí próitéóim Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Tá na sonraí próitéóime mais-speictriméadrachta taiscthe i gComhghuaillíocht ProteomeXchange tríd an stór comhpháirtíochta PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) faoin aitheantóir tacair sonraí PXD020402.
Chun anailís a dhéanamh trí RPLC i dteannta le mais-speictriméadracht ianúcháin leictreaspraeála, ullmhaíodh an coimpléasc RC-LH1 ó Rps cineál fiáin. Ag baint úsáide as an modh a foilsíodh roimhe seo (16), ba é 2 mg ml-1 an tiúchan próitéine a táirgeadh i gcealla palustris i 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl agus 0.03% (m/v) β- (anailís Bio-Rad)) DDM. De réir phrótacal an mhonaróra, bain úsáid as trealamh íonúcháin 2D (GE Healthcare, SAM) chun 10 μg próitéine a bhaint amach tríd an modh deascadh, agus an deascán a thuaslagadh i 20 μl 60% (v/v) aigéad formach (FA), 20% (v/v) aicéatóinítríl agus 20% (v/v) uisce. Rinneadh anailís ar chúig mhicrilítear trí RPLC (Dionex RSLC) i dteannta le mais-speictriméadracht (Maxis UHR-TOF, Bruker). Bain úsáid as colún MabPac 1.2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, an Ríocht Aontaithe) le haghaidh deighilte ag 60 ° C agus 100 μl min -1, le grádán de 85% (v / v) tuaslagóir A [0.1% (v / v) FA agus tuaslagán uiscí 0.02% (V/v) TFA] go 85% (v/v) tuaslagóir B [0.1% (v/v) FA agus 0.02% (v/v) in 90% (v/v) aicéatóinítríle TFA]. Ag baint úsáide as foinse ianúcháin leictreaspraeála chaighdeánach agus paraiméadair réamhshocraithe ar feadh níos mó ná 60 nóiméad, faigheann an speictriméadar maise 100 go 2750 m/z (cóimheas mais-le-lucht). Le cabhair ó uirlis FindPept, tairseach acmhainní bithfhaisnéise ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapáil an speictream maise chuig fo-aonaid an choimpléasc.
Fásadh na cealla ar feadh 72 uair an chloig faoi sholas 100 ml NF-íseal (10μMm-2 s-1), meánach (30μMm-2 s-1) nó ard (300μMm-2 s-1). Meán M22 (meán M22 ina bhfuil sulfáit amóiniam fágtha ar lár agus aicéatáit sóidiam in ionad suicínáit sóidiam) i mbotella scriú-chlúdaigh 100 ml (23). I gcúig thimthriall 30 soicind, cuireadh coirníní gloine 0.1 micrón iontu ag cóimheas toirte 1:1 chun na cealla a bhriseadh agus fuaraíodh ar oighear iad ar feadh 5 nóiméad. Baineadh an t-ábhar dothuaslagtha, na cealla neamhbhriste agus na coirníní gloine trí lártheifneoiriú ag 16,000 RCF ar feadh 10 nóiméad i micrea-lártheifneoir boird. Scaradh an scannán i rótar Ti 70.1 le 100,000 RCF i 20 mM tris-HCl (pH 8.0) le grádán siúcróis 40/15% (m/m) ar feadh 10 n-uaire an chloig.
Mar a thuairiscítear inár gcuid oibre roimhe seo, imdhíon-bhrath an chlib His ar PufW (16). Go hachomair, caolaíodh faoi dhó an coimpléasc croí íonaithe (11.8 nM) nó an membrane ina bhfuil an tiúchan céanna de RC (arna chinneadh trí ocsaídiú, an speictream difríochta laghdaithe á dhealú agus an t-ualach ar an nglóthach dhaite a mheaitseáil) i maolán luchtaithe 2x SDS (Merck, an Ríocht Aontaithe). Scaradh na próitéiní ar ghlóthach macasamhail 12% bis-tris NuPage (Thermo Fisher Scientific, an Ríocht Aontaithe). Daiteadh glóthach le Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, an Ríocht Aontaithe) chun an fho-aonad RC-L a luchtú agus a léirshamhlú. Aistríodh an próitéin ar an dara glóthach chuig membrane fluairíde polaivinilídéine gníomhachtaithe le meatánól (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, an Ríocht Aontaithe) le haghaidh imdhíon-mheasa. Cuireadh bac ar an scannán PVDF i 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 agus 5% (w/v) púdar bainne bearrtha, agus ansin goradh é leis an bpríomh-antasubstaint frith-His (i gcaolú an maoláin antashubstainte [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl agus 0.05% (v/v) Tween-20] i 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, SAM) ar feadh 4 uair an chloig. Tar éis é a ní 3 huaire ar feadh 5 nóiméad i maolán antashubstainte, cuireadh an scannán le chéile le hantashubstaint thánaisteach frith-lucha peirocsaídáis raidis capaill (Sigma-Aldrich, an Ríocht Aontaithe) (caolaithe 1:10,000 i maolán antashubstainte). Goradh chun go bhféadfaí é a bhrath (5 nóiméad tar éis 3 níochán i maolán antashubstainte) ag baint úsáide as foshraith chemiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, an Iodáil) agus Amersham Imager 600 (GE Healthcare, an Ríocht Aontaithe).
Trí dháileadh déine gach lána glóthach dhaite nó imdhíon-mheasa a tharraingt, an limistéar faoin mbuaic a chomhtháthú agus cóimheas déine RC-L (glóthach dhaite) agus Próitéin-W (imdhíon-mheas) a ríomh, i bPróiseáil ImageJ (57) an íomhá. Rinneadh na cóimheasa seo a thiontú go cóimheasa mólaracha trí ghlacadh leis go raibh an cóimheas RC-L le próitéin-W sa sampla íon RC-LH114-W 1:1 agus an tacar sonraí iomlán a normalú dá réir.
Le haghaidh ábhar breise don alt seo, féach http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Is alt rochtana oscailte é seo atá dáilte faoi théarmaí an Cheadúnais Attribution Creative Commons. Ceadaíonn an t-alt úsáid, dáileadh agus atáirgeadh neamhshrianta in aon mheán ar choinníoll go luaitear an saothar bunaidh i gceart.
Nóta: Ní iarrann muid ort ach do sheoladh ríomhphoist a sholáthar ionas go mbeidh a fhios ag an duine a mholann tú don leathanach gur mian leat go bhfeicfidís an ríomhphost agus nach turscar é. Ní ghabhfaimid aon seoltaí ríomhphoist.
Úsáidtear an cheist seo chun tástáil a dhéanamh an cuairteoir thú agus chun cosc ​​a chur ar chur isteach turscair uathoibríoch.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Tugann struchtúr ardtaifigh choimpléasc gaiste solais 1 san ionad imoibrithe léargas nua ar dhinimic an chúinóin.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Tugann struchtúr ardtaifigh choimpléasc gaiste solais 1 san ionad imoibrithe léargas nua ar dhinimic an chúinóin.
©2021 Cumann Meiriceánach um Chur Chun Cinn na hEolaíochta. gach ceart ar cosaint. Tá AAAS ina chomhpháirtí de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. EolaíochtAdvances ISSN 2375-2548.