Reatha *Seoladh reatha: Köln 50931, an Ghearmáin, Taighde ar Fhreagra Struis Cheallach i nGalair a Bhaineann le hAois i Köln (CECAD).
Meastar nach féidir néar-dhíghiniúint galair mitochondrial a aisiompú toisc go bhfuil plaisteacht meitibileach néarón teoranta, ach níl mórán tuisceana ar éifeacht mhífheidhm mitochondrial ar uathriail chealla meitibileachta néarónach sa chorp. Anseo, tugtar isteach próitéóm cille-shonrach néaróin Purkinje a bhfuil easnamh OXPHOS forásach orthu de bharr dinimic chomhleá mitochondrial suaite. Fuaireamar amach gur spreag mífheidhm mitochondrial athrú mór i réimse na próitéimeice, rud a d'fhág go raibh clár meitibileach beacht gníomhachtaithe go seicheamhach roimh bhás cille mar thoradh air. Gan choinne, chinn muid ionduchtú soiléir piruvate carboxylase (PCx) agus einsímí frith-aosaithe eile a fhorlíonann idirmheánacha thimthriall TCA. Chuir cosc ​​ar PCx ​​le strus ocsaídiúcháin agus néar-dhíghiniúint, rud a léiríonn go bhfuil éifeacht chosanta ag atherosclerosis i néaróin nach bhfuil OXPHOS iontu. Déanann athchóiriú an chomhleá mitochondrial i néaróin atá díghinithe go críochfoirt na tréithe meitibileach seo a aisiompú go hiomlán, rud a chuireann cosc ​​ar bhás cille. Aithníonn ár dtorthaí conairí nach raibh ar eolas roimhe seo a thugann athléimneacht do mhífheidhm mitochondrial agus léiríonn siad gur féidir néar-dhíghiniúint a aisiompú fiú sna céimeanna déanacha den ghalar.
Leagtar béim ar ról lárnach na mitochondria i gcothabháil meitibileacht fuinnimh néarónach leis na hairíonna néareolaíocha fairsinge a bhaineann le galair mitochondrial daonna. Is iad sócháin géine a rialaíonn léiriú géine mitochondrial (1, 2) nó scrios géine a bhaineann le dinimic mitochondrial, a théann i bhfeidhm go hindíreach ar chobhsaíocht DNA mitochondrial (mtDNA) (3, 4), is cúis leis an gcuid is mó de na galair seo. Léirigh obair i samhlacha ainmhithe gur féidir conairí meitibileach coimeádacha (5-7) a ghníomhachtú mar fhreagairt ar mhífheidhm mitochondrial i bhfíocháin máguaird, rud a sholáthraíonn faisnéis thábhachtach le haghaidh tuiscint dhomhain ar phaitigineas na ngalar casta seo. I gcodarsnacht ghéar leis sin, tá ár dtuiscint ar na hathruithe meitibileach ar chineálacha sonracha cealla de bharr teip ghinearálta ar tháirgeadh adenosine triphosphate (ATP) mitochondrial inchinne bunúsach (8), rud a chuireann béim ar an ngá atá le spriocanna teiripeacha a aithint ar féidir iad a úsáid chun galair a chosc nó a chosc. Cosc a chur ar néar-dhíghiniúint (9). Is é an easpa faisnéise ná go meastar go forleathan go bhfuil solúbthacht meitibileach an-teoranta ag cealla néaróg i gcomparáid le cineálacha cealla na bhfíochán máguaird (10). Ós rud é go bhfuil ról lárnach ag na cealla seo i gcomhordú sholáthar meitibilítí chuig néaróin chun tarchur sineipteach a chur chun cinn agus freagairt do dhálaí díobhála agus galair, is beag an cumas atá ann meitibileacht cille a oiriúnú do dhálaí dúshlánacha fíochán na hinchinne a theorannú do chealla glial (11-14). Ina theannta sin, cuireann éagsúlacht cheallach dhúchasach fíochán na hinchinne bac mór ar staidéar a dhéanamh ar athruithe meitibileacha a tharlaíonn i bhfoghrúpaí néarónacha sonracha. Mar thoradh air sin, is beag atá ar eolas faoi na hiarmhairtí ceallacha agus meitibileacha beachta a bhaineann le mífheidhm mitochondrial i néaróin.
Chun iarmhairtí meitibileacha mífheidhm mitochondrial a thuiscint, d'aonraíomar néaróin Purkinje (PNanna) i gcéimeanna éagsúla néar-dhíghiniúna de bharr scriosadh comhleá membrane seachtrach mitochondrial (Mfn2). Cé go bhfuil baint ag sócháin Mfn2 i ndaoine le cineál néarapaite céadfach mótair oidhreachtúil ar a dtugtar cineál 2A Charcot-Marie-Tooth (15), is modh aitheanta ionduchtaithe ocsaídiúcháin Fosfarailithe (OXPHOS) é scriosadh coinníollach Mfn2 i lucha. Tá comharthaí néareolaíocha forásacha, amhail neamhoird ghluaiseachta (18, 19) nó ataxia cheirbreallach (16), ag gabháil leis na fochineálacha néarónacha éagsúla (16-19) agus an feinitíopa néar-dhíghiniúna a eascraíonn as. Trí úsáid a bhaint as meascán de phróitéamaíocht chainníochtúil saor ó lipéad (LFQ), meitibilamaíocht, íomháú, agus modhanna víreolaíocha, taispeánaimid go spreagann néar-dhíghiniúint forásach go láidir carbocsaileáis phírúváite (PCx) agus fachtóirí eile a bhfuil baint acu le arteriosclerosis PNanna in vivo Léiriú einsímí. Chun ábharthacht an toraidh seo a fhíorú, laghdaíomar go sonrach léiriú PCx i bPNanna easnamhach Mfn2, agus fuarthas amach gur mhéadaigh an oibríocht seo strus ocsaídiúcháin agus gur luathaigh sí néar-dhíghiniúint, rud a chruthaíonn go dtugann asóspermia bás cille agus inoiriúnaitheacht meitibileach. Is féidir le léiriú dian MFN2 an PN meathlúcháin críochfoirt a tharrtháil go hiomlán a bhfuil easnamh dian OXPHOS, tomhaltas ollmhór DNA mitochondrial, agus líonra mitochondrial briste dealraitheach ann, rud a chuireann béim ar an bhfíric gur féidir leis an gcineál seo néar-dhíghiniúint téarnamh fiú i gcéim ard den ghalar roimh bhás cille.
Chun na mitochondria i bPNanna cnagadh amach Mfn2 a shamhlú, d'úsáideamar stráin luiche a ligeann do mitochondria atá ag brath ar Cre díriú ar léiriú Cre próitéine fluaraiseach buí (YFP) (mtYFP) (20) agus rinneamar seiceáil ar mhórfhoirmiú mitochondrial in vivo. Fuaireamar amach go mbeadh scrios an ghéin Mfn2 i bPNanna ina chúis le deighilt de réir a chéile ar an líonra mitochondrial (Fíor S1A), agus fuarthas an t-athrú is luaithe ag 3 seachtaine d'aois. I gcodarsnacht leis sin, níor thosaigh an meath suntasach ar shraith chealla PN, mar a léirítear le cailliúint imdhíon-dhaite Calbindin, go dtí 12 seachtaine d'aois (Fíor 1, A agus B). Spreag an neamhréir ama idir na hathruithe is luaithe i mórfhoirmiú mitochondrial agus tús infheicthe an bháis néarónaigh sinn chun imscrúdú a dhéanamh ar na hathruithe meitibileacha a spreagann mífheidhm mitochondrial roimh bhás cille. D'fhorbraíomar straitéis bunaithe ar shórtáil cille gníomhachtaithe le fluaraiseacht (FACS) chun PN a léiríonn YFP (YFP+) a leithlisiú (Fíor 1C), agus i lucha rialaithe (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), dá ngairtear CTRL anseo feasta (Fíor S1B). Ligeann uasmhéadú na straitéise geataithe bunaithe ar dhéine choibhneasta chomhartha YFP dúinn corp YFP+ (YFPhigh) de PNanna a íonú ó neamh-PNanna (YFPneg) (Fíor S1B) nó blúirí aicsin/deindríteacha fluaraiseacha ionchasacha (YFPlow; Fíor S1D, ar chlé), arna ndeimhniú ag micreascóp comhfócasach (Fíor S1D, ar dheis). Chun céannacht an daonra aicmithe a fhíorú, rinneamar próitéamaíocht LFQ agus ansin anailís ar phríomhchodanna, agus fuarthas amach go bhfuil deighilt shoiléir idir cealla YFPhigh agus YFPneg (Fíor S1C). Léirigh cealla YFPhigh saibhriú glan marcóirí PNanna aitheanta (i.e. Calb1, Pcp2, Grid2 agus Itpr3) (21, 22), ach gan aon saibhriú próitéiní a léirítear go coitianta i néaróin nó i gcineálacha cealla eile (Fíor 1D)). Léirigh comparáid idir samplaí i gcealla YFPhigh aicmithe a bailíodh i dturgnaimh neamhspleácha comhéifeacht comhghaolmhaireachta > 0.9, rud a léiríonn dea-atáirgtheacht idir macasamhla bitheolaíocha (Fíor S1E). Mar achoimre, bhailíochtúigh na sonraí seo ár bplean le haghaidh aonrú géarmhíochaine agus sonrach PN indéanta. Toisc go spreagann an córas tiománaí L7-cre a úsáideadh athchomhcheangal mósáiceach sa chéad seachtain tar éis breithe (23), thosaíomar ag marú lucha ó CTRL agus ag bailiú néaróin coinníollach (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Tar éis an t-athchomhcheangal a bheith críochnaithe, tugtar Mfn2cKO air ag 4 seachtaine d'aois. Mar chríochphointe, roghnaíomar 8 seachtaine d'aois nuair a bhí an ciseal PN slán in ainneoin an ilroinnt mitochondrial soiléir (Fíor 1B agus Fíor S1A). San iomlán, rinneamar cainníochtú ar 3013 próitéin san iomlán, agus bhí thart ar 22% díobh bunaithe ar anótálacha MitoCarta 2.0 bunaithe ar an bpróitéóm mitochondrial mar mitochondria (Fíor 1E) (Fíor 1E) (24). Léirigh an anailís difreálach ar léiriú géine a rinneadh ag seachtain 8 nach raibh athruithe suntasacha ach ag 10.5% de na próitéiní go léir (Fíor 1F agus Fíor S1F), agus bhí 195 próitéin díobh sin síosrialaithe agus 120 próitéin suasrialaithe (Fíor 1F). Is fiú a thabhairt faoi deara go léiríonn an "anailís conaire nuálach" ar an tacar sonraí seo go mbaineann na géinte a léirítear go difriúil den chuid is mó le sraith srianta de chonairí meitibileach sonracha (Fíor 1G). Is suimiúil é, cé go ndeimhníonn an laghdú ar chonairí a bhaineann le OXPHOS agus comharthaíocht chailciam ionduchtú mífheidhm mitochondrial i PNanna easnamhach comhleá, tá catagóirí eile a bhaineann go príomha le meitibileacht aimínaigéad suasrialaithe go suntasach, rud atá i gcomhréir leis an meitibileacht a tharlaíonn i PNanna mitochondrial. Tá athsreangú comhsheasmhach.
(A) Grianghraif chomhfhócasacha ionadaíocha de rannóga cheirbreallacha lucha CTRL agus Mfn2cKO a thaispeánann cailliúint fhorásach PNanna (calbindin, liath); rinneadh frithdhaite ar na núicléis le DAPI. (B) Cainníochtú (A) (anailís aontreo ar athraitheas, ***P<0.001; n = 4 go 6 chiorcal ó thrí luch). (C) Sreabhadh oibre turgnamhach. (D) Dáileadh léarscáile teasa marcóirí atá sainiúil do Purkinje (barr) agus cineálacha cealla eile (lár). (E) Léaráid Venn a thaispeánann líon na bpróitéiní mitochondrial a aithníodh sa PN aicmithe. (F) Plota bolcánach de phróitéiní a léirítear go difriúil i néaróin Mfn2cKO ag 8 seachtaine (luach scoir suntasachta de 1.3). (G) Taispeánann an anailís ar chonair chruthaitheachta na cúig chonair suasrialála (dearg) agus síosrialála (gorm) is tábhachtaí sa PN Mfn2cKO aicmithe mar 8 seachtaine. Taispeántar meánleibhéal léirithe gach próitéine a braitheadh. Léarscáil teasa liathscála: luach P coigeartaithe. ns, gan tábhacht.
Léirigh sonraí próitéamaíochta gur laghdaigh léiriú próitéine na gcoimpléasc I, III, agus IV de réir a chéile. Bhí fo-aonaid riachtanacha ionchódaithe mtDNA i gcoimpléasc I, III, agus IV, agus níor cuireadh isteach go mór ar choimpléasc II, nach raibh ach cód núicléach air (Fíor 2A agus Fíor S2A). . Ag teacht leis na torthaí próitéamaíochta, léirigh imdhíoneolaíocht na rannóga fíocháin cheirbreallacha gur laghdaigh leibhéal fho-aonaid MTCO1 (fo-aonad 1 ocsaídáis cíteacróim C mitochondrial) de choimpléasc IV i PN de réir a chéile (Fíor 2B). Laghdaíodh an fo-aonad Mtatp8 ionchódaithe mtDNA go suntasach (Fíor S2A), agus d'fhan leibhéal seasta an fho-aonaid sintáis ATP ionchódaithe núicléach gan athrú, rud atá comhsheasmhach leis an gcoimpléasc F1 fo-thionól sintáis ATP cobhsaí ar a dtugtar nuair a bhíonn léiriú mtDNA cobhsaí. Tá an foirmiú comhsheasmhach. Cur isteach (7). Dheimhnigh meastóireacht ar leibhéal an mtDNA sna PNanna sórtáilte Mfn2cKO trí imoibriú slabhrúil polaiméaráise fíor-ama (qPCR) an laghdú de réir a chéile i líon na gcóipeanna mtDNA. I gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, ag 8 seachtaine d'aois, níor coinníodh ach thart ar 20% den leibhéal mtDNA (Fíor 2C). Ag teacht leis na torthaí seo, úsáideadh an ruaimniú micreascópachta comhfhócasach ar PNanna Mfn2cKO chun DNA a bhrath, rud a léiríonn tomhaltas núicléatídí mitochondrial de réir ama (Fíor 2D). Fuaireamar amach nach raibh ach roinnt iarrthóirí a bhí bainteach le díghrádú próitéine mitochondrial agus freagairt struis suasrialaithe, lena n-áirítear Lonp1, Afg3l2 agus Clpx, agus fachtóirí tionóil casta OXPHOS. Níor braitheadh ​​aon athruithe suntasacha i leibhéil na bpróitéiní a bhí bainteach le haipeaptóis (Fíor S2B). Ar an gcaoi chéanna, fuarthas amach nach raibh ach athruithe beaga ar na bealaí mitochondria agus reitineam endoplasmach a bhí bainteach le hiompar cailciam (Fíor S2C). Ina theannta sin, níor aimsíodh aon athruithe suntasacha i meastóireacht ar phróitéiní a bhaineann le huathphagy, rud atá comhsheasmhach leis an ionduchtú infheicthe ar uathphagosóim a breathnaíodh in vivo trí imdhíoneolaíocht agus micreascópacht leictreon (Fíor S3). Mar sin féin, tá athruithe soiléire mitochondrial ultrastruchtúracha ag gabháil leis an mífheidhm OXPHOS forásach i bpróitéiní cothaitheacha (PNanna). Is féidir braislí mitochondrial a fheiceáil i gcorp na gceall agus sna crainn deindreacha de PNanna Mfn2cKO atá 5 agus 8 seachtaine d'aois, agus tá athruithe móra tagtha ar struchtúr an scannáin istigh (Fíor S4, A agus B). Ag teacht leis na hathruithe ultrastruchtúracha seo agus laghdú suntasach ar mtDNA, léirigh anailís ar slisní géarmhíochaine cheirbreacha le heistir meitile teitreameitilrhodamíne (TMRM) go raibh laghdú suntasach tagtha ar phoitéinseal an scannáin mitochondrial i PNanna Mfn2cKO (Fíor S4C).
(A) Anailís ama ar leibhéal léirithe choimpléasc OXPHOS. Ná smaoinigh ach ar phróitéiní le P<0.05 ag 8 seachtaine (ANOVA dhá bhealach). Líne phoncaithe: Gan aon choigeartú i gcomparáid le CTRL. (B) Ar chlé: Sampla de chuid cheirbreallach lipéadaithe le hantashubstaint frith-MTCO1 (barra scála, 20 μm). Tá an limistéar atá á áitiú ag coirp chealla Purkinje clúdaithe le buí. Ar dheis: Cainníochtú leibhéil MTCO1 (anailís aonbhealach ar athraitheacht; n = 7 go 20 cealla anailísithe ó thrí luch). (C) anailís qPCR ar líon cóipe mtDNA sa PN sórtáilte (anailís aonbhealach ar athraitheacht; n = 3 go 7 luch). (D) Ar chlé: Sampla de shlis cheirbreallach lipéadaithe le hantashubstaint frith-DNA (barra scála, 20 μm). Tá an limistéar atá á áitiú ag coirp chealla Purkinje clúdaithe le buí. Ar dheis: Cainníochtú léasanna mtDNA (anailís aonbhealach ar athraitheacht; n = 5 go 9 gcill ó thrí luch). (E) Sampla de chuid cheirbreallach géarmhíochaine a thaispeánann cealla mitoYFP + Purkinje (saighead) i dtaifeadadh clamp paiste cille iomláin. (F) Cainníochtú cuar IV. (G) Taifeadtaí ionadaíocha d'instealladh reatha dípholaraithe i gcealla Purkinje CTRL agus Mfn2cKO. Rian barr: An chéad chuisle a spreag AP. Rian bun: Minicíocht uasta AP. (H) Cainníochtú ionchuir spontáineacha iar-shionapsacha (sPSPanna). Taispeántar an rian taifeadta ionadaíoch agus a chóimheas súmáil i (I). Rinneadh anailís aontreo ar athraitheas ar n = 5 go 20 cealla ó thrí luch. Léirítear sonraí mar mheán±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Rianta ionadaíocha d'AP spontáineach taifeadta ag baint úsáide as an modh clamp paiste pollta. Rian barr: Minicíocht uasta AP. Rian bun: súmáil AP aonair. (K) Cainníochtú an mhinicíocht AP mheánach agus uasta de réir (J). Tástáil Mann-Whitney; rinneadh anailís ar n = 5 chill ó cheithre luch. Léirítear sonraí mar mheán±SEM; níl sé tábhachtach.
Braitheadh ​​damáiste soiléir OXPHOS sa phianbhreith Mfn2cKO 8 seachtaine d'aois, rud a léiríonn go bhfuil feidhm fhiseolaíoch na néarón thar a bheith neamhghnácha. Dá bhrí sin, rinneamar anailís ar shaintréithe leictreacha éighníomhacha néarón easnamhach OXPHOS ag 4 go 5 seachtaine agus 7 go 8 seachtaine trí thaifeadtaí clamp paiste cille iomláin a dhéanamh i slisní géara cheirbrealacha (Fíor 2E). Gan choinne, bhí meánacmhainneacht scíthe membrane agus friotaíocht ionchuir néarón Mfn2cKO cosúil leis an rialú, cé go raibh difríochtaí caolchúiseacha idir cealla (Tábla 1). Ar an gcaoi chéanna, ag 4 go 5 seachtaine d'aois, ní bhfuarthas aon athruithe suntasacha sa chaidreamh reatha-voltais (cuar IV) (Fíor 2F). Mar sin féin, níor mhair aon néaróin Mfn2cKO 7 go 8 seachtaine d'aois an córas IV (céim hipearpolaraithe), rud a léiríonn go bhfuil íogaireacht shoiléir ann maidir le hacmhainneacht hipearpolaraithe ag an gcéim dhéanach seo. I gcodarsnacht leis sin, i néaróin Mfn2cKO, glactar go maith leis na sruthanna dípholaraithe a chruthaíonn urscaoileadh acmhainneachta gníomhaíochta athchleachtach (AP), rud a léiríonn nach bhfuil a bpatrúin urscaoilte foriomlána difriúil go suntasach ó phatrúin néaróin rialaithe 8 seachtaine d'aois (Tábla 1 agus Fíor 2G). Ar an gcaoi chéanna, bhí minicíocht agus aimplitiúid sruthanna iarshionapsacha spontáineacha (sPSCanna) inchomparáide le sruthanna an ghrúpa rialaithe, agus mhéadaigh minicíocht na n-imeachtaí ó 4 seachtaine go 5 seachtaine go 7 seachtaine go 8 seachtaine le méadú comhchosúil (Fíor 2, H agus I). An tréimhse aibithe sineipseach i PNanna (25). Fuarthas torthaí comhchosúla tar éis paistí PNanna pollta. Cuireann an chumraíocht seo cosc ​​​​ar chúiteamh féideartha lochtanna ATP ceallacha, mar a d'fhéadfadh tarlú i dtaifeadadh teanntáin paiste cille iomláin. Go háirithe, níor cuireadh isteach ar an acmhainneacht membrane scíthe agus ar mhinicíocht lámhaigh spontáineach néaróin Mfn2cKO (Fíor 2, J agus K). Mar achoimre, léiríonn na torthaí seo gur féidir le PNanna a bhfuil mífheidhm shoiléir OXPHOS acu déileáil go maith le patrúin urscaoilte ardmhinicíochta, rud a léiríonn go bhfuil meicníocht cúitimh ann a ligeann dóibh freagairtí leictrifhiseolaíocha beagnach gnáth a choinneáil.
Léirítear sonraí mar mheán ± SEM (anailís athraitheas aontreo, tástáil ilchomparáide Holm-Sidak; *P<0.05). Léirítear uimhir an aonaid le lúibíní.
Chuireamar romhainn imscrúdú a dhéanamh ar cibé an raibh conairí in aon chatagóir sa tacar sonraí próitéomaíochta (Fíor 1G) ar féidir leo easnamh tromchúiseach OXPHOS a chomhrac, rud a mhíníonn cén fáth gur féidir le PN atá buailte leictreafiseolaíocht beagnach gnáth a choinneáil (Fíor 2, E go K). Léirigh anailís próitéomaíochta go raibh na heinsímí a bhí páirteach i gcatabalaíocht aimínaigéid slabhra brainseacha (BCAA) suasrialaithe go suntasach (Fíor 3A agus Fíor S5A), agus gur féidir leis an táirge deiridh aicéitil-CoA (CoA) nó succinyl CoA na tricarboxylates i dtimthriall Aigéad arteriosclerosis (TCA) a fhorlíonadh. Fuaireamar amach gur mhéadaigh cion trasamináis 1 BCAA (BCAT1) agus BCAT2 araon. Catalaíonn siad an chéad chéim de chatabalaíocht BCAA trí ghlútamáit a ghiniúint ó α-ketoglutarate (26). Tá gach fo-aonad a chruthaíonn an coimpléasc díhiodráiteas aigéad céató slabhra brainseach (BCKD) suasrialaithe (catalaíonn an coimpléasc an dícharbocsailiú neamh-inchúlghairthe ina dhiaidh sin ar chnámharlach carbóin BCAA mar thoradh air) (Fíor 3A agus Fíor S5A). Mar sin féin, ní bhfuarthas aon athruithe soiléire sa BCAA féin sa PN sórtáilte, a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar an méadú ar iontógáil cheallach na n-aimínaigéad riachtanach seo nó úsáid foinsí eile (glúcós nó aigéad lachtach) chun timthriall an TCA a fhorlíonadh (Fíor S5B). Léirigh PNanna nach raibh OXPHOS iontu méadú ar ghníomhaíochtaí dianscaoilte glútamíne agus tras-aimíniúcháin ag 8 seachtaine d'aois, rud is féidir a léiriú trí suasrialáil na n-einsímí mitochondrial glútamínáis (GLS) agus tras-aimínáis piorúváit glútamíne 2 (GPT2) (Fíor 3, A agus C). Is fiú a thabhairt faoi deara go bhfuil uasrialáil GLS teoranta don isoform spliced ​​glútaminase C (GLS-GAC) (tá an t-athrú ar Mfn2cKO/CTRL thart ar 4.5 oiread, P = 0.05), agus gur féidir lena uasrialáil shonrach i bhfíocháin ailse tacú le bithfhuinneamh mitochondrial. (27).
(A) Taispeánann an léarscáil teasa an t-athrú fillte i leibhéal próitéine don bhealach sonraithe ag 8 seachtaine. (B) Sampla de shlisne cheirbreallach lipéadaithe le hantashubstaint frith-PCx (barra scála, 20 μm). Pointíonn an tsaighead bhuí chuig corp cille Purkinje. (C) Anailís ama ar léiriú próitéine aitheanta mar iarrthóir tábhachtach le haghaidh atheroscléaróis (tástáil t il, *FDR <5%; n = 3-5 luch). (D) Thuas: Léaráid scéimeach a thaispeánann na bealaí éagsúla chun dul isteach sa charbón lipéadaithe atá sa rianaitheoir [1-13C]piruváite (i.e., trí PDH nó bealach tras-artaireach). Bun: Taispeánann an chairt veidhlín céatadán an charbóin aonlipéadaithe (M1) a tiontaíodh go haigéad aspartach, aigéad citreach agus aigéad maileach tar éis slisní géara cheirbreallacha a lipéadú le [1-13C]piruváite (tástáil t péireáilte; ** P <0.01). (E) Anailís chuimsitheach ama ar an gcosán léirithe. Ná cuir san áireamh ach próitéiní le P<0.05 ag 8 seachtaine. Líne stróicthe: gan aon luach coigeartaithe (anailís athraitheas dhá bhealach; * P <0.05; *** P <0.001). Léirítear sonraí mar mheán±SEM.
Inár n-anailís, tá catabolism BCAA anois ar cheann de na príomhbhealaí suasrialála. Tugann an fhíric seo le fios go láidir go bhféadfadh an toirt aerála a théann isteach sa timthriall TCA a bheith athraithe i bpróitéin neamh-inchinne (PN) nach bhfuil OXPHOS ann. D’fhéadfadh sé seo a bheith ina phríomhfhoirm athshreangaithe meitibileach néarónach, a d’fhéadfadh tionchar díreach a bheith aige ar fhiseolaíocht agus ar mharthanas néarónach le linn cothabháil mífheidhm throm OXPHOS. Ag teacht leis an hipitéis seo, fuarthas amach go bhfuil an príomh-einsím frith-atheroscleróiseach PCx suasrialaithe (athraíonn Mfn2cKO/CTRL thart ar 1.5 uair; Fíor 3A), rud a chatalaíonn comhshó pirúváite go oxaloacetate (28), a chreidtear a bheith i bhfíochán inchinne. Tá an léiriú i srianta d’astróicítí (29, 30). Ag teacht leis na torthaí próitéamaíochta, léirigh micreascópacht chomhfhócasach go raibh méadú sonrach agus suntasach ar léiriú PCx i bPNanna easnamhach in OXPHOS, agus go raibh imoibríocht PCx srianta den chuid is mó do na cealla glial Bergmann in aice láimhe den rialú (Fíor 3B). Chun tástáil fheidhmiúil a dhéanamh ar an uasrialú breathnaithe ar PCx, rinneamar slisní géara cheirbreallacha a chóireáil le rianaitheoir pirúváite [1-13C]. Nuair a ocsaídíodh pirúváit le díhiodráitéas pirúváite (PDH), d'imigh a lipéad iseatóp as radharc, ach ionchorpraítear é i measc idirmheánacha timthriall TCA nuair a mheitibilítear pirúváit trí imoibrithe soithíoch (Fíor 3D). Mar thaca lenár sonraí próitéamaíochta, thugamar faoi deara líon mór marcóirí ón rianaitheoir seo in aigéad aspartach slisní Mfn2cKO, agus bhí treocht mheasartha ag aigéad citreach agus aigéad maileach freisin, cé nach raibh sé suntasach (Fíor 3D).
I néaróin dopamine lucha MitoPark a raibh mífheidhm mitochondrial orthu de bharr néaróin dopamine a scriosann an géin fachtóir trascríobh mitochondrial A (Tfam) go sonrach (Fíor S6B), bhí méadú suntasach tagtha ar léiriú PCx freisin (31), rud a léiríonn go bhfuil arteriosclerosis aigéad aicéatóin á rialú le linn mífheidhm OXPHOS néarónach sa chorp. Is fiú a thabhairt faoi deara gur aimsíodh go bhfuil einsímí uathúla (32-34) a d'fhéadfadh a bheith léirithe i néaróin a d'fhéadfadh a bheith bainteach le arteriosclerosis, méadaithe go suntasach i bPNanna nach bhfuil OXPHOS iontu, amhail carbocsaileáis propionyl-CoA (PCC-A), déanann Malonyl-CoA propionyl-CoA a thiontú go succinyl-CoA agus einsím maileach mitochondrial 3 (ME3), arb é a phríomhról piruvate a aisghabháil ó mhalate (Fíor 3, A agus C) (33, 35). Ina theannta sin, fuarthas méadú suntasach san einsím Pdk3, a fhosfarailíonn agus dá bhrí sin a dhíghníomhaíonn PDH (36), agus níor braitheadh ​​aon athruithe san einsím Pdp1 a ghníomhaíonn PDH ná sa choimpléasc einsím PDH féin (Fíor 3A). Go comhsheasmhach, i PNanna Mern2cKO, feabhsaíodh fosfarailiú fho-aonad α1 α (PDHE1α) den chomhpháirt pyruvate dehydrogenase E1 den choimpléasc PDH i Ser293 (ar a dtugtar go gcuireann sé bac ar ghníomhaíocht einsím PDH) (Fíor S6C) (Fíor S6C). Níl aon rochtain soithíoch ag pyruvate.
Ar deireadh, fuarthas amach go bhfuil an sár-chonair de bhithshintéisiú seireine agus glicíne, an timthriall fólait mitochondrial (1C) gaolmhar agus bithshintéisiú próilín (Fíor 1G agus Fíor S5C) suasrialaithe go suntasach, de réir tuairiscí, le linn an phróisis ghníomhachtaithe. Gníomhaítear na fíocháin máguaird le mífheidhm mitochondrial (5-7). Léirigh anailís chomhfhócasach a thacaíonn leis na sonraí próitéamaíochta seo, i PN le OXPHOS ar iarraidh, gur cuireadh slisní ceirbreallacha lucha 8 seachtaine d'aois faoi réir seireine hiodrocsaimeitileatraiseáis 2 (SHMT2), einsím ríthábhachtach de thimthriall fólait mitochondrial. Freagairt imdhíonachta shuntasach (Fíor S5D). I 13 slisní ceirbreallacha géarmhíochaine a goradh le CU-glúcós, dheimhnigh turgnaimh rianaithe meitibileach suasrialáil bithshintéisiú seireine agus próilín tuilleadh, rud a léiríonn gur mhéadaigh sreabhadh isoforms carbóin isteach i seireine agus próilín (Fíor S5E). Ós rud é gurb iad na frithghníomhartha a chuireann GLS agus GPT2 chun cinn atá freagrach as sintéis glutamate ó glútamín agus an tras-aimíniú idir glutamate agus α-céatóglútaráit, léiríonn a n-uasrialú go bhfuil éileamh méadaithe ar glutamate ag néaróin atá easnamhach in OXPHOS. D’fhéadfadh sé seo a bheith dírithe ar bhithshintéis mhéadaithe próilín a choinneáil (Fíor S5C). I gcodarsnacht leis na hathruithe seo, léirigh anailís phróitéómach ar astrocytes cheirbreallacha ó lucha Mfn2cKO atá sainiúil do PN nár athraigh na conairí seo (lena n-áirítear gach frithpheirocsaídáis) go suntasach i léiriú, rud a léiríonn go bhfuil an atreorú meitibileach seo roghnach do PN díghrádaithe (Fíor S6, D go G).
Mar achoimre, léirigh na hanailísí seo patrúin shuntasacha difriúla maidir le gníomhachtú ama conairí meitibileach sonracha i bpanna corónach (PNanna). Cé gur féidir le feidhm neamhghnácha mitochondrial néarónach a bheith ina chúis le atherosclerosis luath agus athmhúnlú 1C (Fíor 3E agus Fíor S5C), agus fiú athruithe intuartha i léiriú coimpléisc I agus IV, níl na hathruithe i sintéis serine de novo le feiceáil ach sna céimeanna déanacha. Ní raibh mífheidhm OXPHOS le feiceáil ach amháin (Fíor 3E agus Fíor S5C). Sainmhíníonn na torthaí seo próiseas seicheamhach ina bhfreagraíonn an mitochondrial (timthriall 1C) agus an cíteaplasma (bíshintéis serine) de bharr struis go sineirgisteach leis an méadú ar atherosclerosis sa timthriall TCA chun meitibileacht néarónach a athmhúnlú.
Is féidir le PNanna atá easnamhach in OXPHOS 8 seachtaine d'aois gníomhaíocht spreagtha ardmhinicíochta a choinneáil agus athcheangal meitibileach suntasach a dhéanamh chun cúiteamh a dhéanamh as mífheidhm mitochondrial. Ardaíonn an fhionnachtain seo féidearthacht spéisiúil go bhféadfadh idirghabháil theiripeach a fháil sna cealla seo, fiú ag an nóiméad seo, chun néar-dhíghiniúint a mhoilliú nó a chosc. Go déanach. Réitigh muid an fhéidearthacht seo trí dhá idirghabháil neamhspleácha. Sa chéad mhodh, dhearamar veicteoir víris a bhaineann le hadéinó (AAV) atá ag brath ar Cre ionas gur féidir MFN2 a chur in iúl go roghnach i PNanna atá easnamhach in OXPHOS in vivo (Fíor S7A). Fíoraíodh an t-AAV a ionchódaíonn MFN2 agus an géin tuairisceora fluaraiseach mCherry (Mfn2-AAV) i gcultúir néarón príomhúla in vitro, rud a d'fhág gur cuireadh MFN2 in iúl ar bhealach atá ag brath ar Cre agus a tharrtháil an mhoirfeolaíocht mitochondrial, rud a chuir cosc ​​ar néar-mhúchadh i néaróin Mfn2cKO (Fíor S7, B, D agus E). Ansin, rinneamar turgnaimh in vivo chun Mfn2-AAV 8 seachtaine d'aois a sheachadadh go steiréatactach chuig an gcoirtéis cheirbreallach i lucha Mfn2cKO agus rialaithe, agus rinneamar anailís ar lucha 12 sheachtain d'aois (Fíor 4A). Fuair ​​na lucha Mfn2cKO a ndearnadh cóireáil orthu bás (Fíor 1, A agus B) (16). Mar thoradh ar thrasduchtú víreasach in vivo, rinneadh roghnach PN a léiriú i roinnt ciorcail cheirbreallacha (Fíor S7, G agus H). Ní ​​raibh aon éifeacht shuntasach ag instealladh an AAV rialaithe a léiríonn mCherry amháin (Ctrl-AAV) ar mhéid an néar-dhíghiniúna in ainmhithe Mfn2cKO. I gcodarsnacht leis sin, léirigh anailís ar Mfn2cKOanna a trasduchtaíodh le Mfn2-AAV éifeacht chosanta shuntasach ar an tsraith chealla PN (Fíor 4, B agus C). Go háirithe, is cosúil go bhfuil dlús na néarón beagnach dodhéanta idirdhealú a dhéanamh idir é agus na hainmhithe rialaithe (Fíor 4, B agus C, agus Fíor S7, H agus I). Tá léiriú MFN1 ach ní MFN2 chomh héifeachtach céanna chun bás néarónach a shábháil (Fíor 4C agus Fíor S7, C agus F), rud a léiríonn gur féidir le léiriú MFN1 eachtópach easnamh MFN2 a fhorlíonadh go héifeachtach. Léirigh anailís bhreise ag an leibhéal PN aonair gur tharrtháil Mfn2-AAV ultrastruchtúr na mitochondria den chuid is mó, gur normalaigh sé leibhéil mtDNA, agus gur aisiompaigh sé léiriú ard an mharcóra frith-angiogenesis PCx ​​(Fíor 4, C go E). Léirigh cigireacht amhairc ar na lucha Mfn2cKO tarrtháilte i riocht scíthe go raibh feabhas tagtha ar a staidiúir agus a gcomharthaí mótair (gluaiseacht S1 go S3). Mar fhocal scoir, léiríonn na turgnaimh seo gur leor ath-thabhairt isteach moillithe MFN2 i PNanna atá an-easnamhach in OXPHOS chun tomhaltas mtDNA a aisiompú agus atherosclerosis a spreagadh, rud a chuireann cosc ​​ar dhíghrádú axon agus bás néarónach in vivo.
(A) Scéim a thaispeánann an sceideal turgnamhach chun AAV a instealladh a ionchódaíonn MFN2 nuair a ghníomhaítear an cosán meitibileach a léirítear. (B) Íomhánna comhfhócasacha ionadaíocha de shlisní cheirbreallacha 12 sheachtain d'aois a trasduchtaíodh ag 8 seachtaine i lucha Mfn2cKO agus lipéadaithe le hantashubstaint frith-Calbindin. Ar dheis: Scálú snáithíní axóin. Is é 450 agus 75 μm scála súmáil an axóin. (C) Ar chlé: Cainníochtú dlús cealla Purkinje i lúb trasduchtaithe AAV (AAV+) (anailís aontreo ar athraitheas; n = 3 luch). Ar dheis: anailís fócais mtDNA i PN trasduchtaithe ag seachtain 12 (tástáil-t neamhphéireáilte; n = 6 chealla ó thrí luch). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Micreaghraif leictreon tarchuir ionadaíocha de PNanna de rannóga cheirbreallacha Mfn2cKO a trasduchtaíodh leis na veicteoirí víreasacha a léirítear. Léiríonn an masc bándearg an limistéar atá á áitiú ag deindrídí, agus léiríonn an chearnóg poncaithe buí an súmáil atá ar fáil ar dheis; seasann n don núicléas. Barra scála, 1μm. Taispeánann (E) sampla de dhaiteadh PCx i PN a trasduchtaíodh ag 12 sheachtain. Barra scála, 20μm. OE, ró-léiriú; FC, athrú fillte.
Ar deireadh, rinneamar imscrúdú ar thábhacht mharthanachta cille spreagtha ag peroxidase i bpéineanna corónach (PNanna) a bhfuil mífheidhm OXPHOS acu. Ghineamar mCherry a ionchódaíonn AAV-shRNA (RNA gearr gruaige) a dhíríonn go sonrach ar mRNA PCx lucha (AAV-shPCx), agus instealladh an víreas nó a rialú scrofa (AAV-scr) isteach sa chearbalam i lucha Mfn2cKO. Rinneadh an t-instealladh sa cheathrú seachtain d'aois (Fíor 5A) chun cnag síos PCx éifeachtach a bhaint amach le linn na tréimhse inar mhéadaigh léiriú PCx (Fíor 3C) agus an ciseal cealla PN fós slán (Fíor 1A). Is fiú a thabhairt faoi deara go mbíonn luasghéarú suntasach ar bhás PN mar thoradh ar chnagadh síos PCx (Fíor S8A), atá teoranta don fháinne ionfhabhtaithe (Fíor 5, B agus C). Chun meicníocht na n-éifeachtaí meitibileach a spreagtar le huasrialáil PCx a thuiscint, rinneamar staidéar ar stádas ocsaídiúcháin athdhíreach PNanna tar éis cnagadh síos PCx agus an bithbhraiteoir optúil Grx1-roGFP2 a léiríodh ag an am céanna ag an am céanna (Fíor S8, B go D) chun an t-athrú coibhneasta ar phoitéinseal ocsaídiúcháin athdhíreach peiptíde (38) i glútaitión a mheas. Ansin, rinneamar micreascópacht íomháithe saoil fluaraiseachta dhá fhótón (FLIM) i slisní géara inchinne Mfn2cKO 7 seachtaine d'aois nó comh-bhruscar rialaithe chun athruithe féideartha i stádas ocsaídiúcháin athdhíreach cíteaplasmach a bhrath tar éis coinníollacha FLIM a fhíorú (Fíor S8, E go G). Léirigh an anailís méadú suntasach ar staid ocsaídiúcháin PNanna Mfn2cKO aonair nach bhfuil léiriú PCx iontu, atá difriúil ó néaróin rialaithe nó PNanna Mfn2cKO nach bhfuil ach shRNA scrofa iontu (Fíor 5, D agus E). Nuair a laghdaíodh léiriú PCx, mhéadaigh céatadán na PNanna Mfn2cKO a léirigh staid an-ocsaídithe níos mó ná trí huaire (Fíor 5E), rud a léiríonn gur chothaigh suasrialáil PCx cumas réadócs néarón meathlaithe.
(A) Scéim a thaispeánann an sceideal turgnamhach chun AAV a ionchódú shPCx a instealladh nuair a ghníomhaítear an cosán meitibileach léirithe. (B) Grianghraif chomhfhócasacha ionadaíocha de rannóga ceirbreallacha 8 seachtaine d'aois i lucha Mfn2cKO a ndearnadh trasduchtú orthu agus a lipéadaíodh le hantashubstaint frith-chailcineurin ag 4 seachtaine. Barra scála, 450μm. (C) Cainníochtú dlús cealla Purkinje i lúba trasduchtaithe AAV (anailís aontreo ar athraitheas; n = 3 go 4 lucha). Léirítear sonraí mar mheán±SEM; ***P<0.001. (D) Taispeánann pictiúr ionadaíoch FLIM meánré saoil PN 7 seachtaine d'aois a léiríonn braiteoir réadócs glútatióin Grx1-roGFP2 faoi na coinníollacha turgnamhacha sonraithe. Cóimheas LUT (tábla cuardaigh): eatramh ama marthanais (i bpiciseicindí). Barra scála, 25μm. (E) Taispeánann an histagram dáileadh luachanna saoil Grx1-roGFP2 ó (D) (n=158 go 368 cealla i dhá luch faoi gach coinníoll). Taispeánann an chairt phíce os cionn gach histagram líon na gcealla a raibh luachanna saoil acu atá i bhfad níos faide (dearg, ocsaídithe) nó níos giorra (gorm, laghdaithe), a sháraíonn 1 SD den mheánluach saoil i CTRL-AAV-scr. (F) Taispeánann an tsamhail atá beartaithe an éifeacht chosanta a bhaineann le huasrialáil PCx néarónach.
Tríd is tríd, léiríonn na sonraí a chuirimid ar fáil anseo gur féidir le hathléiriú MFN2 PN chun cinn a tharrtháil go hiomlán a bhfuil easnamh tromchúiseach OXPHOS orthu, ídiú tromchúiseach mtDNA, agus moirfeolaíocht thar a bheith neamhghnácha cosúil le ista, rud a sholáthraíonn dul chun cinn leanúnach fiú i ngalair chun cinn. Soláthraíonn néar-dhíghiniúint fianaise inchúlaithe ar an gcéim roimh bhás cille. Cuirtear béim bhreise ar an méid solúbthachta meitibileach seo trí chumas néarón atherosclerosis a spreagadh (athshreangú ar thimthriall TCA), rud a chuireann cosc ​​ar léiriú PCx i PNanna nach bhfuil OXPHOS iontu agus a fheabhsaíonn bás cille, agus a imríonn ról cosanta dá bharr (Fíor 5F).
Sa staidéar seo, chuireamar fianaise ar fáil gurb é freagairt na néaróin pharéintéaracha (PNanna) ar mhífheidhm OXPHOS ná teacht le chéile de réir a chéile i dtreo atheroscléaróis timthriall TCA tríd an gcosán gníomhachtaithe difreálach a ghníomhaítear ag cláir meitibileach. Dheimhnigh muid an anailís phróitéómach le go leor modhanna comhlántacha agus nochtamar nuair a bhíonn mífheidhm thromchóineach throm ag néaróin le dúshlán. Ar ár n-iontas, ní gá go marcálann an próiseas athshreangaithe iomlán an staid meitibileach críochfoirt a ghabhann le néar-dhíghiniúint de réir a chéile agus go neamh-inchúlghairthe, ach tugann ár sonraí le fios gur néarón cothabhála é fiú sa chéim roimh bhás cille. Sásra cúitimh feidhmiúil. Léiríonn an fhionnachtain seo go bhfuil leibhéal suntasach plaisteachta meitibileach ag néaróin sa chorp. Cruthaíonn an fhíric seo gur féidir le hath-thabhairt isteach MFN2 níos déanaí léiriú marcóirí meitibileach tábhachtacha a aisiompú agus meath PN a chosc. Os a choinne sin, cuireann sé cosc ​​ar atheroscléaróis agus luasghéaraíonn sé néaróga trasghnéasacha.
Ceann de na torthaí is suimiúla inár dtaighde ná gur féidir le cealla ailse atá gan OXPHOS meitibileacht thimthriall TCA a mhodhnú trí einsímí a uasrialáil a spreagann arteriosclerosis go sonrach. Is gné choitianta de chealla ailse é athchóiriú meitibileach, agus braitheann cuid acu ar glútamín chun idirmheánacha timthriall TCA a fhorlíonadh chun coibhéisí laghdaitheacha a tháirgeadh, a thiomáineann an slabhra riospráide agus a chothaíonn táirgeadh réamhtheachtaithe bithshintéise lipidí agus núicléatíde (39, 40). Léirigh staidéar le déanaí gur gné shuntasach é athcheangal meitibileachta glútamín/glútamáite i bhfíocháin imeallacha a bhfuil mífheidhm OXPHOS orthu (5, 41), áit a mbraitheann treo iontrála glútamíne isteach sa timthriall TCA ar dhéine an díobhála OXPHOS (41). Mar sin féin, níl aon fhianaise shoiléir ann maidir le haon chosúlacht idir plaisteacht meitibileach néarónach sa chorp agus a ábharthacht fhéideartha i gcomhthéacs an ghalair. I staidéar in vitro le déanaí, taispeánadh go n-úsáideann néaróin chortéiseacha príomhúla linnte glútamáite le haghaidh néar-tharchur, rud a chuireann meitibileacht ocsaídiúcháin agus atherosclerosis chun cinn faoi choinníollacha struis meitibileach (42). Is fiú a thabhairt faoi deara, faoi chosc cógaseolaíoch einsím succinate dehydrogenase timthriall TCA, go gcreidtear go gcoinníonn carbocsailiú piorúváite sintéis oxaloacetate i néaróin ghráinníní cheirbreallacha saothraithe (34). Mar sin féin, tá tábhacht fhiseolaíoch fós ag baint le hábharthacht fhiseolaíoch na meicníochtaí seo maidir le fíochán inchinne (áit a gcreidtear go bhfuil atherosclerosis teoranta den chuid is mó d'astrocytes) (43). Sa chás seo, léiríonn ár sonraí gur féidir PNanna a ndearnadh damáiste dóibh ag OXPHOS sa chorp a aistriú chuig díghrádú BCAA agus carbocsailiú piorúváite, arb iad an dá phríomhfhoinse forlíonta idirmheánacha linn snámha TCA iad. Cé gur moladh an ranníocaíocht ionchasach de chatabolism BCAA le meitibileacht fuinnimh néarónach, chomh maith le ról glútamáit agus GABA maidir le néar-tharchur (44), níl aon fhianaise ann fós do na meicníochtaí seo in vivo. Dá bhrí sin, is furasta a thomhas gur féidir le PNanna mífheidhmiúla cúiteamh a dhéanamh go huathoibríoch as tomhaltas idirmheánacha TCA arna dtiomáint ag an bpróiseas asamhlaithe trí atherosclerosis a mhéadú. Go háirithe, d’fhéadfadh go mbeadh gá le huasrialáil PCx chun éileamh méadaithe ar aigéad aspartach a choinneáil, rud a mholtar i gcealla atá ag iomadú le mífheidhm mitochondrial (45). Mar sin féin, níor léirigh ár n-anailís meitibileachta aon athruithe suntasacha i leibhéal seasta aigéad aspartach i PNanna Mfn2cKO (Fíor S6A), rud a léiríonn is dócha an úsáid meitibileach difriúil a bhaintear as aigéad aspartach idir cealla atá ag iomadú agus néaróin iar-mhiotóiseacha. Cé nach bhfuil an mheicníocht chruinn maidir le huasrialáil PCx i néaróin mhífheidhmiúla in vivo tréithrithe fós, léirigh muid go bhfuil ról tábhachtach ag an bhfreagairt roimh am seo i gcothabháil staid ocsaídiúcháin-laghdaithe néarón, rud a léiríodh i dturgnaimh FLIM ar shlisní ceirbreallacha. Go háirithe, is féidir le cosc ​​a chur ar PNanna ó uasrialáil PCx staid níos ocsaídithe a bheith mar thoradh air agus bás cille a luathú. Ní bealaí iad gníomhachtú díghrádaithe BCAA agus carbocsailiú pirúváit chun fíocháin imeallacha mífheidhm mitochondrial a thréithriú (7). Dá bhrí sin, is cosúil gur gné tosaíochta iad de néaróin atá easnamhach in OXPHOS, fiú mura hé an t-aon ghné iad, atá tábhachtach don néar-dhíghiniúint.
Is cineál ilghnéitheach galair néar-dhíghiniúna é galar ceirbreallach a léirítear de ghnáth mar ataxia agus a dhéanann damáiste do PNanna go minic (46). Tá an daonra néarón seo go háirithe leochaileach do mhífheidhm mitochondrial toisc go bhfuil a n-athghiniúint roghnach i lucha leordhóthanach chun go leor de na hairíonna mótair a shainíonn ataxia spinocerebellar daonna a atáirgeadh (16, 47, 48). De réir tuairiscí, tá samhail luiche trasghéineach le géin sóchánach bainteach le hataxia spinocerebellar daonna agus tá mífheidhm mitochondrial aige (49, 50), rud a chuireann béim ar an tábhacht a bhaineann le hiarmhairtí easnaimh OXPHOS i PNPH a staidéar. Dá bhrí sin, tá sé oiriúnach go háirithe an daonra néarón uathúil seo a leithlisiú agus a staidéar go héifeachtach. Mar sin féin, ós rud é go bhfuil PNanna an-íogair do bhrú agus go gcuireann siad cion íseal den daonra cealla ceirbreallach iomlán san áireamh, i gcás go leor staidéar bunaithe ar omics, is gné dúshlánach fós é iad a dheighilt roghnach mar chealla iomlána. Cé go bhfuil sé beagnach dodhéanta easpa iomlán éillithe a bhaint amach ar chineálacha eile cealla (go háirithe fíocháin fásta), chomhcheangail muid céim dhíscaoilte éifeachtach le FACS chun líon leordhóthanach néaróin inmharthana a fháil le haghaidh anailíse próitéimeic iartheachtach, agus tá clúdach próitéine sách ard againn (thart ar 3000 próitéin) i gcomparáid leis an tacar sonraí atá ann cheana féin den cheirbreallam iomlán (51). Trí inmharthanacht na gcealla iomlána a chaomhnú, tugann an modh a chuirimid ar fáil anseo deis dúinn ní hamháin na hathruithe sna conairí meitibileach sna mitochondria a sheiceáil, ach freisin na hathruithe ina gcomhghleacaithe cíteaplasmacha a sheiceáil, rud a chomhlánaíonn úsáid clibeanna membrane mitochondrial chun cineál cealla a shaibhriú An modh nua do líon na mitochondria i bhfíocháin chasta (52, 53). Ní ​​hamháin go bhfuil baint ag an modh a dhéanaimid cur síos air le staidéar ar chealla Purkinje, ach is féidir é a chur i bhfeidhm go héasca ar aon chineál cealla chun aghaidh a thabhairt ar athruithe meitibileach in inchinn bhreoite, lena n-áirítear samhlacha eile de mhífheidhm mitochondrial.
Ar deireadh, tá fuinneog theiripeach aitheanta againn le linn an phróisis athchóirithe meitibileach seo ar féidir léi príomhchomharthaí struis cheallaigh a aisiompú go hiomlán agus meath néarónach a chosc. Dá bhrí sin, d’fhéadfadh tuiscint a fháil ar impleachtaí feidhmiúla an athshreangaithe a thuairiscítear anseo léargas bunúsach a thabhairt ar chóireálacha féideartha chun inmharthanacht néarónach a choinneáil le linn mífheidhm mitochondrial. Tá gá le taighde amach anseo atá dírithe ar athruithe i meitibileacht fuinnimh i gcineálacha eile cealla inchinne a dhíchóimeáil chun infheidhmeacht an phrionsabail seo maidir le galair néareolaíocha eile a nochtadh go hiomlán.
Tá cur síos déanta ar lucha MitoPark roimhe seo (31). Tá cur síos déanta ar lucha C57BL/6N le géinte Mfn2 taobhach le loxP roimhe seo (18) agus crosáladh iad le lucha L7-Cre (23). Ansin, crosáladh an sliocht dúbailte heitrisigeach a lean as sin le lucha homaisigeacha Mfn2loxP/Mfn2loxP chun cnag-amach géine Purkinje-shonracha a ghiniúint do Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). I bhfo-thacar cúplála, tugadh isteach an ailéil Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) trí chrosálacha breise (20). Rinneadh na nósanna imeachta ainmhithe go léir de réir threoirlínte Eorpacha, náisiúnta agus institiúideacha agus cheadaigh LandesamtfürNatur de Umwelt agus Verbraucherschutz, Réin Thuaidh-Westphalia, an Ghearmáin. Leanann obair ainmhithe treoir Chónaidhm Eorpach na gCumann Eolaíochtaí Ainmhithe Saotharlainne freisin.
Tar éis dí-áitiú ceirbheacsach na mná torracha a ainéistéisiú, leithlisítear suth na luiche (E13). Scaipeadh an cortex i dTuaslagán Salainn Chothrom Hanks (HBSS) a raibh 10 mM Hepes curtha leis agus cuireadh ar aghaidh é ar Mheán Iolair Modhnaithe Dulbecco ina raibh papain (20 U/ml) agus cisteín (1μg/ml). Gor an fíochán i DMEM) agus dícheangal é trí dhíleá einsímeach. (Ml) ag 37°C ar feadh 20 nóiméad, agus ansin muilte go meicniúil i DMEM a raibh 10% séiream féatais bólachta curtha leis. Cuireadh na cealla ar chlúdachghloine atá brataithe le polailísín ag dlús 2 × 106 in aghaidh an mhias cultúir 6 cm nó ag dlús 0.5 × 105 cealla/cm2 le haghaidh anailíse íomháithe. Tar éis 4 uair an chloig, cuireadh meán saor ó shéiream Neurobasal ina raibh 1% forlíonadh B27 agus 0.5 mM GlutaMax in ionad an mheáin. Coinníodh na néaróin ansin ag 37°C agus 5% CO2 ar feadh an turgnaimh, agus beathaíodh iad uair sa tseachtain. Chun athchuingriú a spreagadh in vitro, úsáideadh 3μl (mias cultúir 24-tholl) nó 0.5μl (pláta 24-tholl) den veicteoir víris AAV9 seo a leanas chun néaróin a chóireáil ar an dara lá in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, uimhir chatalóige 105530-AAV9) agus AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, uimhir chatalóige 105545-AAV9).
Tá DNA comhlántach Mfn1 agus Mfn2 lucha (a fuarthas ó phlasmaid #23212 agus #23213 Addgene, faoi seach) marcáilte leis an seicheamh V5 (GKPIPNPLLGLDST) ag an C-chríoch, agus tá siad comhleáite le mCherry sa fhráma tríd an seicheamh T2A. Is bronntanas ó Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) é Grx1-roGFP2. Trí chaiséad tdTomato a athsholáthar ag baint úsáide as modhanna clónála traidisiúnta, rinneadh an caiséad a fho-chlónáil isteach sa chnámh droma pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (uimhir thagartha Addgene 28306) chun veicteoirí pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 agus pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 a ghiniúint. Baineadh úsáid as straitéis chomhchosúil chun an veicteoir rialaithe pAAV-CAG-FLEX-mCherry a ghiniúint. Chun an tógáil AAV-shPCx a ghiniúint, tá veicteoir plasmaid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ag teastáil, ina bhfuil an seicheamh DNA a chódálann an shRNA atá dírithe ar PCx ​​luiche (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Faoi rialú an phromotóra U6, úsáidtear mCherry faoi rialú an phromotóra CMV. Rinneadh táirgeadh veicteoirí cúnta AAV de réir threoracha an mhonaróra (Cell Biolabs). I mbeagán focal, bain úsáid as plasmaid aistrithe ina bhfuil mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) go neamhbhuan. Trasfheistiú géine códaithe 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) nó Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), chomh maith le próitéin chaipsíde AAV1 agus próitéin chúnta a chódú. Pacáistiú plasmaid, ag baint úsáide as an modh fosfáit chailciam. Fuarthas an forshnáithín víris amh trí thimthriallta reo-leá i ndabhach oighir thirim/eatánóil agus rinneadh cealla a lysis i saline maolánaithe fosfáite (PBS). Rinneadh an veicteoir AAV a íonú trí ultra-lártheifneoiriú grádáin iaidicsanóil neamhleanúnach (24 uair an chloig ag 32,000 rpm agus 4°C) agus comhchruinníodh é ag baint úsáide as scagaire lártheifneoir Amicon ultra-15. Rinneadh tíotar géanóim AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 cóip géanóim (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX mar a thuairiscíodh roimhe seo (54), agus tomhaiseadh é le PCR cainníochtúil fíor-ama (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) agus AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Scríobadh néaróin phríomhúla i PBS oighir-fhuar 1x, rinneadh millíní díobh, agus ansin rinneadh homaiginiú orthu i maolán líse 0.5% Triton X-100 / 0.5% dí-ocsaicholait sóidiam/PBS ina raibh fosfatáis agus coscaire próitéáis (Roche). Rinneadh cainníochtú próitéine trí úsáid a bhaint as an measúnacht aigéad bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Scaradh na próitéiní ansin trí leictreafóiréis glóthach pola-aicrilimíde SDS, agus ansin blottáladh iad ar scannán fluairíde polaivinilidéine (GE Healthcare). Blocáil suíomhanna neamhshonracha agus goradh leis an antashubstaint phríomhúil (féach Tábla S1 le haghaidh sonraí) i mbainne 5% i TBST (salann Tris-maolaithe le Tween), céimeanna níocháin agus antashubstaint thánaisteach i TBST Incubate. Goradh leis an antashubstaint phríomhúil thar oíche ag +4°C. Tar éis níocháin, cuir an antashubstaint thánaisteach i bhfeidhm ar feadh 2 uair an chloig ag teocht an tseomra. Ina dhiaidh sin, tríd an blot céanna a ghoradh le hantashubstaint frith-β-achtin, deimhníodh an luchtú céanna. Brath trí thiontú go ceimiluminescence agus ceimiluminescence a fheabhsú (GE Healthcare).
Socraíodh na néaróin a cuireadh ar chlúdachghloine roimhe sin le 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS ag an bpointe ama sonraithe ag teocht an tseomra ar feadh 10 nóiméad. Ar dtús, sreabhann 0.1% Triton X-100/PBS trí na clúdachghloine ar feadh 5 nóiméad ag teocht an tseomra, agus ansin i maolán blocála [3% albaimin séiream bólachta (BSA)/PBS]. Ar an dara lá, nitear na clúdachghloine le maolán blocála agus goradh iad leis an antashubstaint thánaisteach fluairfóir-chomhchuingeach cuí ar feadh 2 uair an chloig ag teocht an tseomra; ar deireadh, nitear na samplaí go maith i PBS le 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) frithdhaite agus ansin socraítear iad ar an sleamhnán micreascóip le Aqua-Poly/Mount.
Rinneadh lucha (fireann agus baineann) a ainéistéisiú trí instealladh infhearainneach de chetamine (130 mg/kg) agus xylazine (10 mg/kg) agus tugadh faoi chois iad le faoiseamh pianmhar carprofen (5 mg/kg), agus cuireadh iad in ionstraim steiréatachtach (Kopf) atá feistithe le ceap te. Nochtadh an cloigeann agus bain úsáid as druil fiaclóireachta chun an chuid den cortex cheirbreach a fhreagraíonn don chnámh mis (ó lambda: eireaball 1.8, cliathánach 1, a fhreagraíonn do na lobules IV agus V) a thanú. Bain úsáid as snáthaid steallaire cuartha chun poll beag a chruthú go cúramach sa chloigeann chun cur isteach ar an vasculature thíos. Ansin cuirtear an ribeadán gloine tanaí tarraingthe isteach go mall sa mhicrea-pholl (ó -1.3 go -1 ar thaobh ventral an dura mater), agus instealladh 200 go 300 nl AAV isteach sa mhicrea-insteallóir (Narishige) le steallairí láimhe (Narishige) arís agus arís eile ag brú íseal thar thréimhse ama 10 go 20 nóiméad. Tar éis an insteallta, cuir an ribeadán ann ar feadh 10 nóiméad eile chun ligean don víreas scaipeadh go hiomlán. Tar éis na ribeadáin a bhaint amach, déantar an craiceann a fhuáil go cúramach chun athlasadh na créachta a íoslaghdú agus chun ligean don ainmhí téarnamh. Rinneadh na hainmhithe a chóireáil le faoisimh pian (caspofen) ar feadh roinnt laethanta tar éis na hoibríochta, agus le linn an ama sin rinneadh monatóireacht chúramach ar a riocht fisiciúil agus ansin rinneadh iad a eotanáisiú ag an bpointe ama sonraithe. Rinneadh na nósanna imeachta go léir i gcomhréir le treoirlínte Eorpacha, náisiúnta agus institiúideacha agus cheadaigh LandesamtfürNatur de Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, an Ghearmáin iad.
Rinneadh na hainmhithe a ainéistéisiú le cetamine (100 mg/kg) agus xylazine (10 mg/kg), agus rinneadh an croí a phulsiú le 0.1 M PBS ar dtús, agus ansin le 4% PFA i PBS. Rinneadh an fíochán a dhíscaoileadh agus a shocrú i 4% PFA/PBS thar oíche ag 4°C. Baineadh úsáid as scian chreathach (Leica Microsystems GmbH, Vín, an Ostair) chun rannóga sagittal (50 μm tiubh) a ullmhú ón inchinn shocraithe i PBS. Mura sonraítear a mhalairt, rinneadh ruaimniú ar na rannóga saor-snámhacha mar a thuairiscítear thuas (13) ag teocht an tseomra agus iad ag corraigh. Go hachomair, ar dtús, rinneadh na slisní a fuarthas a thréscaoilte le 0.5% Triton X-100/PBS ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra; i gcás roinnt eipitóp (Pcx agus Shmt2), trí na slisní a théamh i maolán tris-EDTA ag 80°C (PH 9) ar feadh 25 nóiméad in ionad na céime seo. Ansin, rinneadh na codanna a ghoradh le hantashubstaint phríomhúil (féach Tábla S1) i maolán blocála (3% BSA/PBS) ag 4°C thar oíche agus iad á gcorrú. An lá dár gcionn, niteadh na codanna le maolán blocála agus goradh iad leis an antashubstaint thánaisteach chuí atá comhchuingithe le fluairfóir ar feadh 2 uair an chloig ag teocht an tseomra; ar deireadh, niteadh na codanna go maith i PBS, rinneadh iad a fhrithdhaite le DAPI, agus ansin socraíodh iad le AquaPolymount ar shleamhnán micreascóip.
Baineadh úsáid as micreascóp comhfhócasach scanadh léasair (TCS SP8-X nó TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) a raibh léasar solais bháin agus léasar ultraivialait dé-óid 405 feistithe air chun an sampla a íomháú. Trí spreagadh a thabhairt don fhluairifór agus an comhartha a bhailiú le Brathadóir Hibrideach (HyDs), baineadh úsáid as bogearraí LAS-X chun íomhánna cruachta a bhailiú a bhí i gcomhréir le sampláil Nyquist i mód seicheamhach: i gcás painéil neamhchainníochtúla, is comharthaí an-dinimiciúla iad (mar shampla, i gcealla sómacha agus i ndeindrídí) (mtYFP) Bain úsáid as HyD chun líon na bPNanna a bhrath i mód BrightR). Cuirtear geataíocht ó 0.3 go 6 ns i bhfeidhm chun an cúlra a laghdú.
Íomháú fíor-ama de chealla sórtáilte. Tar éis sórtála i meán Neurobasal-A ina raibh 1% forlíonadh B27 agus 0.5 mM GlutaMax, cuireadh síolta cealla láithreach ar shleamhnáin ghloine atá brataithe le polai-l-lísín (μ-Slide8 Well, Ibidi, uimhir chatalóige 80826), agus ansin coinníodh ag 37°C agus 5% CO2 iad ar feadh 1 uair an chloig chun ligean do na cealla socrú síos. Rinneadh íomháú fíor-ama ar mhicreascóp comhfhócasach scanadh léasair Leica SP8 atá feistithe le léasar bán, HyD, lionsa cuspóir ola 63×[1.4 cró uimhriúil (NA)] agus céim téimh.
Rinneadh an luch a ainéistéisiú go tapa le dé-ocsaíd charbóin agus baineadh ceann di, baineadh an inchinn as an gcloigeann go tapa, agus gearradh ina cuid sagittal í 200μm ar tiús (le haghaidh turgnamh lipéadaithe 13C) nó 275μm ar tiús (le haghaidh turgnamh dhá fhótón) a líonadh leis na hábhair seo a leanas. Líontar an uachtar reoite (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, an Ghearmáin) leis na substaintí seo a leanas: 125 mM NaCl oighir-fhuar, sáithithe le carbóin (95% O2 agus 5% CO2) íseal-Ca2 + sreabhán ceirbreach-dromlaigh saorga (ACSF), 2.5 mM KCl, 1.25 mM maolán fosfáite sóidiam, 25 mM NaHCO3, 25 mM glúcós, 0.5 mM CaCl2 agus 3.5 mM MgCl2 (brú osmóiseach de 310 go 330 mmol). Aistrigh na slisní inchinne a fuarthas chuig seomra réamh-ghoir ina bhfuil Ca2 + ACSF níos airde (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM maolán fosfáite sóidiam, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glúcós, 1.0 mM CaCl2 agus 2.0 mM MgCl2) Meán) pH 7.4 agus 310 go 320 mmol).
Le linn an phróisis íomháithe, aistríodh na slisní isteach i seomra íomháithe tiomnaithe, agus rinneadh an turgnamh faoi shreabhadh leanúnach ACSF ag teocht tairiseach idir 32° agus 33°C. Baineadh úsáid as micreascóp scanadh léasair ilfótón (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) a raibh lionsa cuspóir Leica 25x (NA 0.95, uisce) agus léasar Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) feistithe air le haghaidh íomháú na slisní. Modúl FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. Rinneadh na hathruithe i staid réadócs cíteaplasmach na bPNanna a thomhas le FLIM dhá-fótón i slisní inchinne sagittal, áit a raibh an bithbhraiteoir Grx1-roGFP2 ag díriú ar PNanna. Sa chiseal PN, roghnaítear an réimse fála thart ar 50 go 80 μm faoi dhromchla an tsleasa chun a chinntiú go bhfuil PN inmharthana ann (is é sin, easpa struchtúir coirnínigh nó athruithe moirfeolaíocha néarónacha feadh na ndeindrídí) agus an braiteoir roGFP2 dúbailte dearfach agus shRNA PCx ionchódaithe AAV nó a sheicheamh rialaithe (gach ceann acu ag comhléiriú mCherry). Bailigh íomhánna aon-staca le súmáil dhigiteach 2x [tonnfhad spreagtha: 890 nm; 512 nm 512 picteilín]. Brath: úsáidtear HyD inmheánach, grúpa scagaire fluaraiséin iseitiocianáit (FITC)] agus meánú íomhá laistigh de 2 go 3 nóiméad chun a chinntiú go mbailítear go leor fótón (1000 fótón san iomlán) le haghaidh feistiú cuar. Rinneadh íogaireacht an tóireadóir Grx1-roGFP2 agus fíorú coinníollacha FLIM trí luach saoil roGFP2 a mhonatóiriú agus 10 mM H2O2 eisgéineach á chur leis an ACSF insreabhach (chun ocsaídiú a uasmhéadú, rud a fhágann go méadaítear an saolré), agus ansin 2 mM déthiotreitól á chur leis (laghdaíonn sé seo an méid laghdaithe, rud a fhágann go laghdaítear an saolré) (Fíor S8, D go G). Bain úsáid as bogearraí FLIMfit 5.1.1 chun na torthaí a fuarthas a anailísiú, an cuar meathlaithe easpónentúil aonair den íomhá iomlán a fheistiú leis an IRF tomhaiste (feidhm freagartha ionstraime), agus tá χ2 thart ar 1. Chun saolré PN aonair a ríomh, tarraingíodh an masc timpeall ar chorp na néaróg de láimh, agus úsáideadh an meánsaolré i ngach masc le haghaidh cainníochtaithe.
Anailís ar phoitéinseal miteacondrial. Tar éis an chuid ghéarmhíochaine a ghoradh le 100 nM TMRM curtha go díreach leis an ACSF perfused ar feadh 30 nóiméad, tomhaiseadh na hathruithe ar phoitéinseal miteacondrial PNanna le micreascóp dhá fhótón. Rinneadh íomháú TMRM tríd an tóireadóir a spreagadh ag 920 nm agus HyD inmheánach (iseatóicianáit teitreameitilrhodamíne: 585/40 nm) a úsáid chun comharthaí a bhailiú; trí úsáid a bhaint as an tonnfhad spreagtha céanna ach HyD inmheánach difriúil (FITC: 525/50) chun íomháú a dhéanamh ar mtYFP. Bain úsáid as breiseán Áireamhán Íomhá ImageJ chun poitéinseal miteacondrial a mheas ag leibhéal na cille aonair. Go hachomair, úsáidtear an chothromóid breiseáin: comhartha = min (mtYFP, TMRM) chun an réigiún miteacondrial a thaispeánann an comhartha TMRM i Purkinje Somali san íomhá chomhfhócasach aon-stac den chainéal comhfhreagrach a aithint. Ansin déantar an limistéar picteilín sa masc mar thoradh air sin a chainníochtú, agus ansin déantar é a normalú ar an íomhá aon-stac tairseach chomhfhreagrach den chainéal mtYFP chun an codán mitochondrial a thaispeánann an poitéinseal mitochondrial a fháil.
Rinneadh an íomhá a dhíchonvolú le bogearraí Huygens Pro (Scientific Volume Íomháú). I gcás na bpictiúr scanta de thíleanna, déantar montáis de thíl aonair ag baint úsáide as an algartam fuála uathoibríoch a sholáthraíonn bogearraí LAS-X. Tar éis calabrú na híomhá, bain úsáid as ImageJ agus Adobe Photoshop chun an íomhá a phróiseáil tuilleadh agus an gile agus an chodarsnacht a choigeartú go haonfhoirmeach. Bain úsáid as Adobe Illustrator le haghaidh ullmhúcháin ghrafaic.
Anailís fócais mtDNA. Rinneadh líon na ngortuithe mtDNA a chainníochtú ar chodanna cheirbreallacha lipéadaithe le hantashubstaintí i gcoinne DNA trí mhicreascóp comhfhócasach. Cruthaíodh gach limistéar sprice do chorp na cille agus do núicléas gach cille, agus ríomhadh an limistéar faoi seach ag baint úsáide as an mbreiseán Multi Measure (bogearraí ImageJ). Bain an limistéar núicléasach ó limistéar chorp na cille chun an limistéar cíteaplasmach a fháil. Ar deireadh, úsáideadh an breiseán Analyze Particles (bogearraí ImageJ) chun na pointí DNA cíteaplasmacha a léiríonn mtDNA ar an íomhá tairsí a chainníochtú go huathoibríoch, agus rinneadh na torthaí a fuarthas a normalú go dtí meán PN lucha CTRL. Léirítear na torthaí mar mheánlíon na núicléasídí in aghaidh na cille.
Anailís ar léiriú próitéine. Bain úsáid as breiseán Áireamhán Íomhá ImageJ chun léiriú próitéine i PN a mheas ag leibhéal na cille aonair. Go hachomair, san íomhá chomhfhócasach aonchiseal den chainéal comhfhreagrach, tríd an gcothromóid: comhartha = min (mtYFP, antashubstaint), sainaithnítear an réigiún mitochondrial a thaispeánann imdhíonghníomhaíocht d'antashubstaint áirithe i Purkina. Ansin déantar an limistéar picteilín sa masc mar thoradh air sin a chainníochtú, agus ansin déantar é a normalú ar an íomhá aon-stac tairseach chomhfhreagrach den chainéal mtYFP chun an codán mitochondrial den phróitéin taispeánta a fháil.
Anailís ar dhlús cealla Purkinje. Baineadh úsáid as breiseán Cell Counter de chuid ImageJ chun dlús Purkinje a mheas trí líon na gcealla Purkinje a comhaireamh a roinnt ar fhad an fháinne cheirbrealaigh a bhfuil na cealla a comhaireamh ina gcónaí ann.
Ullmhú agus bailiú samplaí. Socraíodh inchinn an ghrúpa rialaithe agus lucha Mfn2cKO i 2% PFA/2.5% glutaraldehyde i maolán fosfáite 0.1 M (PB), agus ansin ullmhaíodh rannóga corónacha ag baint úsáide as ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vín, an Ostair) (Tiús 50 go 60 μm). Ansin socraíodh i maolán PB i 1% os teitreaocsaíd agus 1.5% feirocianíd photaisiam ag teocht an tseomra ar feadh 1 uair an chloig. Níodh na rannóga trí huaire le huisce driogtha, agus ansin dhaite le 70% eatánól ina raibh 1% aicéatáit úráinile ar feadh 20 nóiméad. Díhiodráitíodh na rannóga ansin in alcól grádaithe agus leabaithe i roisín eapocsa Durcupan ACM (roisín réitigh Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, uimhir chatalóige 14040) idir sleamhnáin ghloine brataithe le sileacan, agus ar deireadh ag 60°C polaiméiríodh san oigheann ar feadh 48 uair an chloig. Roghnaíodh limistéar an choirtéis cheirbrealaigh agus gearradh codanna ultrathanaí 50 nm ar Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vín, an Ostair) agus roghnaíodh iad ar eangach scoilte copair 2 × 1 mm atá brataithe le scannán polaistiréin. Daiteadh na codanna le tuaslagán de 4% aicéatáit úráinile in H2O ar feadh 10 nóiméad, nite le H2O arís agus arís eile iad, ansin le citráit luaidhe Reynolds in H2O ar feadh 10 nóiméad, agus ansin nite le H2O arís agus arís eile. Tógadh micreagraif le micreascóp leictreon tarchurtha Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM) ag baint úsáide as ceamara digiteach TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, SAM). An Ghearmáin).
I gcás lucha a raibh AAV orthu, scaradh an inchinn agus gearradh ina cuid sagittal 1 mm ar tiús í, agus scrúdaíodh an ceirbreall ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta chun an fáinne atá ionfhabhtaithe le AAV (is é sin, mCherry a léiríonn é) a aithint. Ní úsáidtear ach turgnaimh ina mbíonn éifeachtúlacht thrasduchtaithe an-ard i gciseal cealla Purkinje (i.e. beagnach an ciseal iomlán) in dhá fháinne ceirbreallacha as a chéile ar a laghad mar thoradh ar instealladh AAV. Rinneadh micrea-dhíscaoileadh ar an lúb trasduchtaithe AAV le haghaidh socrúcháin thar oíche (4% PFA agus 2.5% glutaraldehyde i maolán cócóáit 0.1 M) agus rinneadh tuilleadh próiseála air. Chun EPON a leabú, niteadh an fíochán socraithe le maolán cócóáit sóidiam 0.1 M (Applichem), agus goradh é le 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) i maolán cócóáit sóidiam 0.1 M (Applichem) ar feadh 4 uair an chloig, ansin nigh ar feadh 2 uair an chloig. Déan arís 3 huaire le maolán cócaimíde 0.1 M. Ina dhiaidh sin, úsáideadh an tsraith ardaitheach eatánóil chun gach tuaslagán eatánóil a ghoradh ag 4°C ar feadh 15 nóiméad chun an fíochán a dhíhiodráitiú. Aistríodh an fíochán go hocsaíd próipiléine agus goradh thar oíche é in EPON (Sigma-Aldrich) ag 4°C. Cuir an fíochán in EPON úr ag teocht an tseomra ar feadh 2 uair an chloig, agus ansin leabaigh isteach é ag 62°C ar feadh 72 uair an chloig. Bain úsáid as ultramhicríotóm (Leica Microsystems, UC6) agus scian diamant (Diatome, Biel, an Eilvéis) chun rannóga ultrathanaí 70 nm a ghearradh, agus ruaimnigh le 1.5% aicéatáit úráinile ar feadh 15 nóiméad ag 37°C, agus ruaimnigh le tuaslagán citráit luaidhe ar feadh 4 nóiméad. Tógadh na micreagraif leictreon ag baint úsáide as micreascóp leictreon tarchurtha JEM-2100 Plus (JEOL) a raibh Camera OneView 4K 16-giotán (Gatan) agus bogearraí DigitalMicrograph (Gatan) feistithe leis. Chun anailíse, fuarthas micreagraif leictreon le súmáil dhigiteach 5000× nó 10,000×.
Anailís mhoirfeolaíoch ar mitochondria. I gcás na n-anailísí uile, rinneadh imlíne mitochondria aonair a leagan amach de láimh in íomhánna digiteacha ag baint úsáide as bogearraí ImageJ. Déantar anailís ar pharaiméadair mhoirfeolaíocha éagsúla. Léirítear dlús mitochondrial mar chéatadán a fhaightear trí achar mitochondrial iomlán gach cille a roinnt ar achar an chíteaplasma (achar an chíteaplasma = achar na cille-achar núicléas na cille) × 100. Ríomhtar cruinne na mitochondria leis an bhfoirmle [4π∙(achar/imlíne 2)]. Rinneadh anailís ar mhoirfeolaíocht ista na mitochondria agus roinneadh ina dhá chatagóir (“feadánach” agus “blister”) de réir a bpríomhchruthanna.
Anailís ar líon agus dlús autofagasóim/liseasóim. Bain úsáid as bogearraí ImageJ chun imlínte gach autofagasóim/liseasóim a leagan amach de láimh san íomhá dhigiteach. Léirítear achar an autofagasóim/liseasóim mar chéatadán a ríomhtar trí achar iomlán struchtúir autofagasóim/liseasóim gach cille a roinnt ar achar an chíteaplasma (achar an chíteaplasma = achar na cille-achar an núicléis) × 100. Ríomhtar dlús na n-autofagasóim/liseasóim tríd an líon iomlán a roinnt ar líon na struchtúr autofagasóim/liseasóim in aghaidh na cille (i dtéarmaí achar an chíteaplasmaigh) (achar an chíteaplasmaigh = achar na cille-achar an núicléis).
Lipéadú le haghaidh rannánú géarmhíochaine agus ullmhú samplaí. I gcás turgnaimh a bhfuil lipéadú glúcóis ag teastáil uathu, aistrigh na slisní géarmhíochaine inchinne chuig seomra réamh-ghoir, ina bhfuil carbón sáithithe (95% O2 agus 5% CO2), ACSF ard Ca2 + (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, maolán fosfáite sóidiam 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glúcós, 1.0 mM CaCl2 agus 2.0 mM MgCl2, coigeartaithe go pH 7.4 agus 310 go 320 mOsm), ina bhfuil glúcós ina ionadú 13C6-glúcóis (Eurisotop, uimhir chatalóige CLM-1396). I gcás turgnaimh a bhfuil lipéadú piorúváite ag teastáil uathu, aistrigh na slisní géara inchinne go Ca2 + ACSF níos airde (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, maolán fosfáite sóidiam 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glúcós, 1.0 mM CaCl2 agus cuir 2.0mM MgCl2 leis, coigeartaigh go pH 7.4 agus 310 go 320mOsm), agus cuir 1mM 1-[1-13C]pirúváit (Eurisotop, uimhir chatalóige CLM-1082) leis. Gor na codanna ar feadh 90 nóiméad ag 37°C. Ag deireadh an turgnaimh, niteadh na codanna go tapa le tuaslagán uiscí (pH 7.4) ina raibh 75 mM carbónáit amóiniam, agus ansin rinneadh iad a homaiginiú in aicéatóinítríl (ACN) 40:40:20 (v:v:v): meatánól: uisce. Tar éis na codanna a ghoradh ar oighear ar feadh 30 nóiméad, rinneadh na samplaí a lártheifneoiriú ag 21,000 g ar feadh 10 nóiméad ag 4°C, agus triomaíodh an forshnáithín soiléir i gcomhchruinnitheoir SpeedVac. Stóráladh an milléad meitibilít triomaithe a lean as sin ag -80°C go dtí go ndearnadh anailís air.
Anailís crómatagrafaíochta leachta-mais-speictriméadrachta ar aimínaigéid lipéadaithe le 13C. Le haghaidh anailíse crómatagrafaíochta leachta-mais-speictriméadrachta (LC-MS), athfhionraíodh an milléad meitibilíte i 75μl d'uisce grád LC-MS (Honeywell). Tar éis lártheifneoirithe ag 21,000 g ar feadh 5 nóiméad ag 4°C, úsáideadh 20 μl den fhorshnáithín soiléirithe le haghaidh anailíse flosc aimínaigéid, agus úsáideadh an chuid eile den sliocht láithreach le haghaidh anailíse anion (féach thíos). Rinneadh anailís aimínaigéid ag baint úsáide as an bprótacal díorthaithe clóiríd beinsóile a thuairiscíodh roimhe seo (55, 56). Sa chéad chéim, cuireadh 10μl de charbónáit sóidiam 100 mM (Sigma-Aldrich) le 20μl d'sliocht meitibilíte, agus ansin cuireadh 10μl de chlóiríd beinsóile 2% (Sigma-Aldrich) leis an ACN grád LC. Rinneadh an sampla a chroitheadh ​​go hachomair agus ansin rinneadh lártheifneoiriú air ag 21,000 g ar feadh 5 nóiméad ag 20°C. Aistrigh an forshnáithín glanta go fial uathshamplóra 2 ml le hiontráil ghloine cónúil (toirt 200 μl). Rinneadh anailís ar na samplaí ag baint úsáide as an gcóras LC ultra-ardfheidhmíochta Acquity iClass (Waters) atá ceangailte leis an mais-speictriméadar cruinneas ardtaifigh Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Chun críocha anailíse, instealladh 2μl den sampla díorthaithe i gcolún shilice T3 ard-neart 100 × 1.0 mm (Waters) ina bhfuil 1.8μm de cháithníní. Is é 100μl/nóim an ráta sreafa, agus tá maolán A (formáit amóiniam 10 mM agus 0.15% aigéad formach in uisce) agus maolán B (ACN) sa chóras maoláin. Seo a leanas an grádán: 0%B ag 0 nóiméad; 0%B. 0 go 15% B ag 0 go 0.1 nóiméad; 15 go 17% B ag 0.1 go 0.5 nóiméad; B ag 17 go 55% ag 0.5 go 14 nóiméad; B ag 55 go 70% ag 14 go 14.5 nóiméad; ag 14.5 go 70 go 100% B ag 18 nóiméad; 100% B ag 18 go 19 nóiméad; 100 go 0% B ag 19 go 19.1 nóiméad; 0% B ag 19.1 go 28 nóiméad (55, 56). Oibríonn an mais-speictriméadar QE-HF i mód ianúcháin dhearfaigh le raon maise m/z (cóimheas maise/luchta) de 50 go 750. Is é 60,000 an taifeach feidhmeach, agus is é 3 × 106 an sprioc ian rialaithe gnóthachain (AGC) a fhaightear, agus is é 100 milleasoicind an t-am ian uasta. Oibríonn an fhoinse ianúcháin leictreaspraeála téite (ESI) ag voltas spraeála de 3.5 kV, teocht ribeach de 250 °C, sreabhadh aeir sceite de 60 AU (aonaid threallacha), agus sreabhadh aeir cúnta de 20 AU. 250 °C. Tá an lionsa S socraithe go 60 AU.
Anailís crómatagrafaíochta anion-MS ar aigéid orgánacha lipéadaithe le 13C. Rinneadh anailís ar an deascán meitibilíte atá fágtha (55μl) ag baint úsáide as córas crómatagrafaíochta ian Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) atá ceangailte le mais-speictriméadar QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Go hachomair, instealladh 5μl d'eastóscán meitibilíte i gcolún Dionex IonPac AS11-HC atá feistithe le HPLC (2 mm × 250 mm, méid cáithníní 4μm, Thermo Fisher Scientific) i mód lúb páirteach brú isteach le cóimheas líonta de 1.) Colún garda Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Coinnítear teocht an cholúin ag 30°C, agus socraítear an t-uath-shamplálaí go 6°C. Bain úsáid as datha hiodrocsaíde potaisiam a sholáthraítear le huisce dí-ianaithe chun grádán hiodrocsaíde potaisiam a ghiniúint tríd an ngineadóir eluent. Deighilt meitibilítí ag ráta sreafa 380μl/nóim, agus an grádán seo a leanas á chur i bhfeidhm: 0 go 3 nóiméad, 10 mM KOH; 3 go 12 nóiméad, 10 go 50 mM KOH; 12 go 19 nóiméad, 50 go 100 mM KOH; 19 go 21 nóiméad, 100 mM KOH; 21 go 21.5 nóiméad, 100 go 10 mM KOH. Athchothromaíodh an colún faoi 10 mM KOH ar feadh 8.5 nóiméad.
Cuirtear na meitibilítí eisilte le chéile le sruth forlíonta isopropanol 150μl/nóiméad i ndiaidh an cholúin agus ansin treoraítear iad chuig mais-speictriméadar ardtaifigh atá ag feidhmiú i mód ianúcháin dhiúltaigh. Tá MS ag monatóireacht an raoin maise ó m/z 50 go 750 le taifeach de 60,000. Tá an AGC socraithe go 1 × 106, agus coinnítear an t-am ian uasta ag 100 ms. Oibríodh an fhoinse ESI téite ag voltas spraeála de 3.5 kV. Is iad seo a leanas socruithe eile na foinse ian: teocht ribeach 275°C; sreabhadh gáis sheath, 60 AU; sreabhadh gáis chúnta, 20 AU ag 300°C, agus socrú lionsa S go 60 AU.
Anailís sonraí ar mheitibilítí lipéadaithe le 13C. Bain úsáid as bogearraí TraceFinder (leagan 4.2, Thermo Fisher Scientific) le haghaidh anailís sonraí ar chóimheas iseatóp. Rinneadh céannacht gach comhdhúile a fhíorú le comhdhúil thagartha iontaofa agus rinneadh anailís neamhspleách uirthi. Chun anailís saibhrithe iseatóp a dhéanamh, baineadh achar an chrómatagram ian eastósctha (XIC) de gach iseatóp 13C (Mn) as [M + H]+, áit a seasann n do uimhir charbóin an chomhdhúil sprice, a úsáidtear chun aimínaigéid a anailísiú nó [MH]+ a úsáidtear chun anion a anailísiú. Tá cruinneas maise XIC níos lú ná cúig chuid in aghaidh an mhilliúin, agus is é 0.05 nóiméad cruinneas RT. Déantar an anailís saibhrithe trí chóimheas gach iseatóp braite a ríomh le suim na n-iseatóp uile den chomhdhúil chomhfhreagrach. Tugtar na cóimheasa seo mar luachanna céatadáin do gach iseatóp, agus léirítear na torthaí mar chéatadán saibhrithe mólar (MPE), mar a thuairiscíodh roimhe seo (42).
Rinneadh an millín néarón reoite a homaiginiú i meatánól oighir-fhuar 80% (v/v), a chorraíl, agus a ghoradh ag -20°C ar feadh 30 nóiméad. Corraíl an sampla arís agus corraigh ag +4°C ar feadh 30 nóiméad. Lártheifneoiríodh an sampla ag 21,000 g ar feadh 5 nóiméad ag 4°C, agus ansin bailíodh an forshnáithín a lean agus triomaíodh é ag baint úsáide as comhchruinnitheoir SpeedVac ag 25°C le haghaidh anailíse ina dhiaidh sin. Mar a thuairiscítear thuas, rinneadh anailís LC-MS ar aimínaigéid na gcealla sórtáilte. Ag baint úsáide as TraceFinder (leagan 4.2, Thermo Fisher Scientific), rinneadh anailís sonraí ag baint úsáide as mais mhonaiseatópach gach comhdhúile. Rinneadh normalú cainníochta ar shonraí meitibilíte ag baint úsáide as an bpacáiste bogearraí preprocessCore (57).
Ullmhúchán slisne. Rinneadh an luch a ainéistéisiú go tapa le dé-ocsaíd charbóin agus baineadh ceann di, baineadh an inchinn as an gcloigeann go tapa, agus úsáideadh an scian chreathach líonta le hoighear (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, an Ghearmáin) chun í a ghearradh ina codanna sagittal 300 go 375 μm. Gású fuar carbóin (95% O2 agus 5% CO2) Ca2 + ACSF Íseal (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, maolán fosfáite sóidiam 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glúcós, 1.0 mM CaCl2 agus 6.0 mM MgCl2. Coigeartaigh go pH 7.4 agus 310 go 330 mOsm). Aistrigh na slisní inchinne a fuarthas go seomra ina bhfuil Ca2 + ACSF níos airde (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM maolán fosfáite sóidiam, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glúcós, 4.0 mM CaCl2 agus mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 agus 310 go 320 mOsm). Stóráil na slisní ar feadh 20 go 30 nóiméad ionas gur féidir iad a athchóiriú roimh an taifeadadh.
taifeadadh. Baineadh úsáid as stáitse micreascóip a raibh seomra taifeadta seasta agus lionsa cuspóir tumoideachais uisce 20x (Scientifica) feistithe air do na taifeadtaí uile. Aithníodh na cealla Purkinje toimhdeacha trí (i) mhéid an choirp, (ii) suíomh anatamaíoch an cheirbreallaim, agus (iii) léiriú an ghéin tuairisceora fluaraiseach mtYFP. Tarraingítear an pipéad paiste le friotaíocht barr de 5 go 11 meigeacóim amach le ribeadán gloine borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, an Ghearmáin) agus pipéad cothrománach Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Rinneadh na taifeadtaí uile le aimplitheoir teanntáin paiste ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, an Ghearmáin), a bhí faoi rialú ag an mbogearra Signal (leagan 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, an Ríocht Aontaithe). Taifeadadh an turgnamh ag ráta samplála de 12.5 kHz. Déantar an comhartha a scagadh le dhá scagaire Bessel gearr-phas le minicíochtaí scoite de 1.3 agus 10 kHz faoi seach. Déantar toilleas an scannáin agus an phípéid a chúiteamh leis an gciorcad cúitimh ag baint úsáide as an aimplitheoir. Rinneadh na turgnaimh uile faoi rialú ceamara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, an Ghearmáin), a bhí á rialú ag bogearraí Hokawo (leagan 2.8, Hamamatsu, Gerden, an Ghearmáin).
Cumraíocht agus anailís ghnáthamh ar an gceall iomlán. Díreach roimh an taifeadadh, líon an pípéad leis an tuaslagán inmheánach ina bhfuil na substaintí seo a leanas: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM glúcónáit photaisiam, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) agus 10.0 mM creatinine fosfáit a coigeartaíodh go pH 7.25, agus ba é 290 mOsm (siúcrós) an brú osmóiseach. Díreach tar éis fórsa 0 pA a chur i bhfeidhm chun an membrane a bhriseadh, tomhaiseadh an poitéinseal membrane scíthe. Tomhaistear an fhriotaíocht ionchuir trí shruthanna hipearpolaraithe de -40, -30, -20, agus -10 pA a chur i bhfeidhm. Tomhais méid an fhreagartha voltais agus bain úsáid as dlí Ohm chun an fhriotaíocht ionchuir a ríomh. Taifeadadh gníomhaíocht spontáineach i dteanntán voltais ar feadh 5 nóiméad, agus aithníodh agus tomhaiseadh sPSC in Igor Pro (leagan 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, SAM) ag baint úsáide as script aitheantais leath-uathoibríoch. Tomhaistear cuar IV agus sruth seasta tríd an gceallraí a theanntán ag poitéinsil éagsúla (ag tosú ó -110 mV) agus an voltas a mhéadú i gcéimeanna 5 mV. Rinneadh tástáil ar tháirgeadh AP trí shruth dípholaraithe a chur i bhfeidhm. Teanntán an chill ag -70 mV agus cuisle reatha dípholaraithe á chur i bhfeidhm. Coigeartaigh méid céime gach aonaid taifeadta ar leithligh (10 go 60 pA). Ríomh an mhinicíocht AP uasta trí na spící cuisle is cúis leis an minicíocht AP is airde a chomhaireamh de láimh. Déantar anailís ar an tairseach AP trí úsáid a bhaint as an dara díorthach den chuisle dípholaraithe a spreagann AP amháin nó níos mó ar dtús.
Cumraíocht agus anailís paiste pollta. Déan taifeadadh paiste pollta ag baint úsáide as prótacail chaighdeánacha. Bain úsáid as pipéad saor ó ATP agus GTP nach bhfuil na comhábhair seo a leanas ann: 128 mM glúcónáit K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA agus 2 mM MgCl2, agus coigeartaigh go pH 7.2 (ag baint úsáide as KOH). Fágtar ATP agus GTP ar lár ón tuaslagán intraceallach chun tréscaoilteacht neamhrialaithe an scannáin cille a chosc. Líontar an pipéad paiste le tuaslagán inmheánach ina bhfuil amfaitéirícin (thart ar 200 go 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) chun taifead paiste pollta a fháil. Tuaslagadh amfaitéirícin i sulfocsaíd démheitil (tiúchan deiridh: 0.1 go 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ní ​​raibh aon éifeacht shuntasach ag tiúchan an DMSO a úsáideadh ar na néaróin a ndearnadh staidéar orthu. Le linn an phróisis pollta, rinneadh monatóireacht leanúnach ar fhriotaíocht an chainéil (Ra), agus cuireadh tús leis an turgnamh tar éis d'aimplitiúid Ra agus AP cobhsú (20-40 nóiméad). Tomhaistear gníomhaíocht spontáineach i dteanntán voltais agus/nó reatha ar feadh 2 go 5 nóiméad. Rinneadh anailís sonraí ag baint úsáide as Igor Pro (leagan 7.05.2, WaveMetrics, SAM), Excel (leagan 2010, Microsoft Corporation, Redmond, SAM) agus GraphPad Prism (leagan 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Stáit Aontaithe Mheiriceá). Chun APanna spontáineacha a aithint, úsáidtear breiseán NeuroMatic v3.0c IgorPro. Aithin APanna go huathoibríoch ag baint úsáide as tairseach ar leith, a choigeartaítear ina n-aonar do gach taifead. Ag baint úsáide as an eatramh spíce, cinntigh minicíocht na spíce leis an uasmhinicíocht spíce meandarach agus an mheánmhinicíocht spíce.
Aonrú PN. Trí oiriúnú don phrótacal a foilsíodh roimhe seo, rinneadh PNanna a íonú ón gceireabal lucha ag céim shonraithe (58). Go hachomair, rinneadh an ceireabal a dhíscaoileadh agus a mhionú i meán díscaoilte oighir-fhuar [gan HBSS Ca2+ agus Mg2+, arna fhorlíonadh le 20 mM glúcós, peinicillin (50 U/ml) agus streiptimícin (0.05 mg/ml)], agus ansin an meán a dhíleá i bpapain [HBSS, arna fhorlíonadh le 1-cisteín·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) agus dí-ocsairibonúicléáis I (DNase I; 0.1 mg/ml)]. Déan cóireáil ar feadh 30 nóiméad ag 30°C. Ar dtús nigh na fíocháin i meán HBSS ina bhfuil múcas uibhe (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) agus DNase (0.1 mg/ml) ag teocht an tseomra chun díleá einsímeach a chosc, agus ansin sa mheán HBSS ina bhfuil 20 mM glúcós. Scaoiltear cealla aonair go réidh i HBSS le peinicillin (50 U/ml), streiptimícin (0.05 mg/ml) agus DNase (0.1 mg/ml). Scagadh an fionraí cille mar thoradh air sin trí chriathar cille 70μm, ansin rinneadh na cealla a mhilléadú trí lártheifneoiriú (1110 rpm, 5 nóiméad, 4°C) agus athfhionraíodar iad i meán sórtála [HBSS, forlíonta le 20 mM glúcós, 20% séiream féatais bólachta], peinicillin (50 U/ml) agus streiptimícin (0.05 mg/ml)]; déan inmharthanacht na gceall a mheas le iaidíd propidiam agus coigeartaigh dlús na gceall go 1×106 go 2×106 cealla/ml. Roimh an gcítiméadracht sreafa, scagadh an fionraí trí chriathar cealla 50 μm.
Sreabh-chítiméadar. Rinneadh sórtáil cille ag 4°C ag baint úsáide as meaisín FACSAria III (BD Biosciences) agus bogearraí FACSDiva (BD Biosciences, leagan 8.0.1). Rinneadh an fhionraí cille a shórtáil ag baint úsáide as soic 100 μm faoi bhrú 20 psi ag ráta ~2800 imeacht/soic. Ós rud é nach féidir le critéir thraidisiúnta geataithe (méid na cille, idirdhealú démhódach, agus tréithe scaipthe) a chinntiú go ndéantar PN a leithlisiú i gceart ó chineálacha eile cille, socraítear an straitéis geataithe bunaithe ar chomparáid dhíreach idir déine agus uathfhluaraiseacht YFP i lucha mitoYFP+ ​​agus rialaithe mitoYFP −. Spreagtar YFP tríd an sampla a ionradaíocht le líne léasair 488 nm, agus braitear an comhartha ag baint úsáide as scagaire pasbhanda 530/30 nm. I lucha mitoYFP+, úsáidtear neart coibhneasta an ghéin tuairisceora Rosa26-mitoYFP freisin chun blúirí coirp néarónach agus aicsin a idirdhealú. Déantar 7-AAD a spreagadh le léasar buí 561 nm agus a bhrath le scagaire banda-pas 675/20 nm chun cealla marbha a eisiamh. Chun astrocytes a dheighilt ag an am céanna, rinneadh an fionraí cille a dhaite le ACSA-2-APC, ansin rinneadh an sampla a ionradaíocht le líne léasair 640 nm, agus úsáideadh scagaire banda-pas 660/20 nm chun an comhartha a bhrath.
Rinneadh na cealla bailithe a mhilleadh trí lártheifneoiriú (1110 rpm, 5 nóiméad, 4°C) agus stóráladh iad ag -80°C go dtí go n-úsáidfí iad. Aicmítear lucha Mfn2cKO agus a gcuid coileáiníní ar an lá céanna chun athraitheacht nós imeachta a íoslaghdú. Rinneadh cur i láthair agus anailís sonraí FACS ag baint úsáide as bogearraí FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, SAM).
Mar a luadh thuas (59), úsáidtear PCR fíor-ama chun DNA a leithlisiú ó na néaróin sórtáilte le haghaidh cainníochtú mtDNA ina dhiaidh sin. Rinneadh tástáil ar an líneacht agus ar íogaireacht tairsí ar dtús trí qPCR a rith ar líon difriúil cealla. Go hachomair, bailigh 300 PN i maolán líse ina bhfuil 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 agus próitéináis K (200 ng/ml) agus goradh ag 55°C ar feadh 120 nóiméad. Goradh na cealla ina dhiaidh sin ag 95°C ar feadh 10 nóiméad chun a chinntiú go raibh próitéináis K díghníomhachtaithe go hiomlán. Ag baint úsáide as tóireadóir TaqMan (Thermo Fisher) atá sainiúil do mt-Nd1, tomhaiseadh mtDNA trí PCR leathchainníochtúil sa chóras PCR Fíor-Ama 7900HT (Thermo Fisher Scientific). géinte Science, uimhir chatalóige Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, uimhir chatalóige AIVI3E8) agus 18S (Thermo Fisher Scientific, uimhir chatalóige Hs99999901_s1).
Ullmhúchán sampla próitéóime. Trí an tuaslagán a théamh ag 95°C ar feadh 10 nóiméad agus é a soniciú, sa mhaolán líse [clóiríd guanidine 6 M, hidreaclóiríd fosfíne tris(2-carbocsaieitile) 10 mM, clóraicéatamíd 10 mM agus millíní néarón reoite tris-100 mM - líseáil i HCl]. Ar Bioruptor (Diagenode) ar feadh 10 nóiméad (tréimhse cuisle 30 soicind / sos 30 soicind). Caolaíodh an sampla 1:10 i 20 mM tris-HCl (pH 8.0), measctha le 300 ng ór trypsin (Promega), agus goradh thar oíche ag 37°C chun díleá iomlán a bhaint amach. Ar an dara lá, rinneadh lártheifneoiriú ar an sampla ag 20,000 g ar feadh 20 nóiméad. Caolaíodh an forshnáithín le 0.1% aigéad formach, agus díshalannaíodh an tuaslagán le StageTips féindhéanta. Triomaíodh an sampla in ionstraim SpeedVac (concentrator Eppendorf plus 5305) ag 45°C, agus ansin cuireadh an peiptíd ar fionraí in aigéad formach 0.1%. Ullmhaíodh na samplaí go léir ag an am céanna ag an duine céanna. Chun samplaí astrocyte a anailísiú, lipéadaíodh 4 μg de pheiptídí díshalannaithe le clib mais tandem (TMT10plex, uimhir chatalóige 90110, Thermo Fisher Scientific) le cóimheas peiptíde le himoibrí TMT de 1:20. Chun lipéadú TMT a dhéanamh, athfhionraíodh 0.8 mg d'imoibrí TMT i 70 μl d'ACN neamhhidriúil, agus athchóiríodh an peiptíd triomaithe i 9 μl de 0.1 M TEAB (décharbónáit tríeitileamóiniam), agus cuireadh 7 μl d'imoibrí TMT in ACN leis. Ba é 43.75% an tiúchan. Tar éis 60 nóiméad goradáin, múchadh an t-imoibriú le 2 μl de hiodrocsa-aimín 5%. Bailíodh na peiptídí lipéadaithe, triomaíodh iad, athfhionraíodh iad i 200μl d'aigéad formach (FA) 0.1%, roinneadh ina dhá leath iad, agus ansin díshalannaíodh iad ag baint úsáide as StageTips féindéanta. Ag baint úsáide as crómatagrafaíocht leachtach ultra-ardfheidhmíochta UltiMate 3000 (crómatagrafaíocht leachtach ultra-ardfheidhmíochta UltiMate 3000), rinneadh ceann den dá leath a chodánú ar cholún crómatagrafaíochta Acquity 1mm x 150mm a bhí líonta le cáithníní C18 130Å1.7μm (Waters, Uimhir chatalóige SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Deighil na peiptídí ag ráta sreafa 30μl/nóim, scar ó mhaolán B 1% go 50% ar feadh 85 nóiméad le grádán céimneach de 96 nóiméad, ó mhaolán B 50% go 95% ar feadh 3 nóiméad, ansin 8 nóiméad le haghaidh Maolán B 95%. Is é atá i maolán A ná 5% ACN agus 10 mM décharbónáit amóiniam (ABC), agus is é atá i maolán B ná 80% ACN agus 10 mM ABC. Bailigh codáin gach 3 nóiméad agus cuir le chéile iad i dhá ghrúpa (1 + 17, 2 + 18, srl.) agus triomaigh iad i lártheifneoir folúis.
Anailís LC-MS/MS. I gcás mais-speictriméadrachta, scaradh na peiptídí (uimhir r119.aq) ar cholún anailíseach PicoFrit 25 cm, 75 μm trastomhas istigh (lionsa cuspóir nua, uimhir pháirte PF7508250) atá feistithe le meán ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch, mata), Bain úsáid as EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, an Ghearmáin). Coinníodh an colún ag 50°C. Is 0.1% aigéad formach in uisce agus 0.1% aigéad formach i 80% ACN iad maoláin A agus B, faoi seach. scaradh na peiptídí ó mhaolán B 6% go 31% ar feadh 65 nóiméad agus ó mhaolán B 31% go 50% ar feadh 5 nóiméad le grádán de 200 nl/nóim. Rinneadh anailís ar na peiptídí eisilte ar speictriméadar maise Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Déantar tomhas m/z ar réamhtheachtaí peiptíde le taifeach 120,000 sa raon 350 go 1500 m/z. Ag baint úsáide as 27% de fhuinneamh imbhuailte normalaithe, roghnaítear an réamhtheachtaí is láidre le staid luchta de 2 go 6 le haghaidh scoilteadh díscaoilte gaiste C ardfhuinnimh (HCD). Socraítear an t-am timthrialla go 1 s. Tomhaiseadh luach m/z an blúire peiptíde sa ghaiste ian ag baint úsáide as an sprioc AGC is lú de 5 × 104 agus an t-am insteallta uasta de 86 ms. Tar éis ilroinnt, cuireadh an réamhtheachtaí ar an liosta eisiaimh dinimiciúil ar feadh 45 s. Scaradh peiptídí lipéadaithe le TMT ar cholún Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, uimhir chatalóige 164942), agus rinneadh anailís ar na speictrim imirce ar speictriméadar maise Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) atá feistithe le trealamh ian tonnfhoirmeacha neamhshiméadracha ard-réimse (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) a oibríonn ag dhá voltas cúitimh de −50 agus −70 V. Úsáidtear MS3 a roghnaíodh bunaithe ar an réamhtheachtaí sioncrónaithe le haghaidh tomhas comhartha ian tuairiscithe TMT. Rinneadh an scaradh peiptíde ar EASY-nLC 1200, ag baint úsáide as eisilte grádáin líneach 90%, le tiúchan maoláin de 6% go 31%; ba é 0.1% FA maolán A, agus ba é 0.1% FA agus 80% ACN maolán B. Oibrítear an colún anailíseach ag 50°C. Bain úsáid as FreeStyle (leagan 1.6, Thermo Fisher Scientific) chun an comhad bunaidh a scoilt de réir an voltais chúitimh FAIMS.
Aitheantas agus cainníochtú próitéine. Ag baint úsáide as an inneall cuardaigh comhtháite Andromeda, rinneadh anailís ar na sonraí bunaidh ag baint úsáide as MaxQuant leagan 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Chomh maith leis na seichimh athchomhcheangail Cre agus YFP a fuarthas ó Aequorea victoria, rinneadh cuardach ar speictrim blúirí peiptíde le haghaidh an tseicheamh canónach agus an tseicheamh isoform den phróitéóm tagartha luiche (Proteome ID UP000000589, íoslódáilte ó UniProt i mBealtaine 2017). Socraíodh ocsaídiú meitiainín agus aicéitiliú N-críochfoirt próitéine mar mhodhnuithe athraitheacha; socraíodh meitiliú carbamóile cisteíne mar mhodhnuithe seasta. Socraítear na paraiméadair díleá go "sonrachas" agus "trypsin/P". Is é 1 an líon íosta peiptídí agus peiptídí rásúir a úsáidtear le haghaidh aithint próitéine; is é 0 an líon íosta peiptídí uathúla. Faoi na coinníollacha meaitseáil léarscáile peiptíde, ba é 0.01 an ráta aitheantais próitéine. Tá an rogha "An Dara Peiptíd" cumasaithe. Bain úsáid as an rogha “meaitseáil idir ritheanna” chun sainaitheantais rathúla a aistriú idir comhaid bhunaidh éagsúla. Bain úsáid as comhaireamh cóimheas íosta LFQ 1 le haghaidh cainníochtú saor ó lipéad (LFQ) (60). Déantar déine an LFQ a scagadh le haghaidh dhá luach bailí ar a laghad i ngrúpa géinitíopa amháin ar a laghad ag gach pointe ama, agus déantar é a eastóscadh ó dháileadh gnáth le leithead .0.3 agus bog síos 1.8. Bain úsáid as ardán ríomhaireachta Perseus (https://maxquant.net/perseus/) agus R (https://r-project.org/) chun torthaí an LFQ a anailísiú. Baineadh úsáid as tástáil t mheasartha dhá bhealach ón bpacáiste bogearraí limma le haghaidh anailíse difreálach ar léiriú (61). Déantar anailís taiscéalaíoch ar shonraí ag baint úsáide as ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally agus pheatmap. Rinneadh anailís ar na sonraí próitéamaíochta bunaithe ar TMT ag baint úsáide as MaxQuant leagan 1.6.10.43. Cuardaigh sonraí próitéamaíochta amha ó bhunachar sonraí próitéamaíochta daonna UniProt, a íoslódáladh i Meán Fómhair 2018. Áirítear leis an anailís an fachtóir ceartúcháin íonachta iseatóp arna sholáthar ag an monaróir. Bain úsáid as limma in R le haghaidh anailíse difreálach léirithe. Stóráiltear na sonraí bunaidh, torthaí cuardaigh an bhunachair shonraí, agus sreabhadh oibre agus torthaí na hanailíse sonraí i gcomhghuaillíocht ProteomeXchange tríd an stór comhpháirtíochta PRIDE leis an aitheantóir tacair sonraí PXD019690.
Saibhríonn anótálacha feidhmiúla an anailís. Baineadh úsáid as an uirlis Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) chun saibhreas théarmaí anótála feidhmiúla an tacair sonraí a chinneadh ag 8 seachtaine (Fíor 1). Go hachomair, úsáidtear an liosta próitéine cainníochtúil a fhaightear ó anailís sonraí LC-MS/MS (speictriméadracht maise tandem) leis na critéir scagaire seo a leanas: Roghnaítear Mus musculus mar an speiceas agus an cúlra, agus taispeánann an chatagóir an luach P arna choigeartú ag Benjamini le haghaidh saibhrithe 0.05 nó níos ísle a mheastar a bheith suntasach. Don ghraf seo, taispeántar na cúig chatagóir bhreise is fearr i ngach braisle bunaithe ar an luach P coigeartaithe. Ag baint úsáide as tástáil t il, ag baint úsáide as clár borrtha líneach dhá chéim Benjamini, Krieger, agus Yekutieli (Q = 5%), déantar anailís léirithe próitéine thar chúrsa ama ar na hiarrthóirí tábhachtacha a shainaithnítear i ngach catagóir, agus déantar anailís ar gach ró ar leithligh. Níl aon ghá le SD comhsheasmhach a ghlacadh.
Chun torthaí an staidéir seo a chur i gcomparáid le bunachair shonraí foilsithe agus léaráid Venn a ghiniúint i bhFíor 1, chomhcheangail muid an liosta próitéine cainníochtúil le hanótálacha MitoCarta 2.0 (24). Bain úsáid as an uirlis ar líne Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) chun an léaráid a ghiniúint.
Le haghaidh faisnéis mhionsonraithe ar na nósanna imeachta staitistiúla a úsáidtear le haghaidh anailíse próitéimeice, féach ar an rannóg chomhfhreagrach d’Ábhair agus Modhanna. Maidir le gach turgnamh eile, is féidir faisnéis mhionsonraithe a fháil san finscéal comhfhreagrach. Mura sonraítear a mhalairt, léirítear na sonraí go léir mar mheán ± SEM, agus rinneadh na hanailísí staitistiúla go léir ag baint úsáide as bogearraí GraphPad Prism 8.1.2.
Le haghaidh ábhar breise don alt seo, féach http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Is alt rochtana oscailte é seo atá dáilte faoi théarmaí an Cheadúnais Creative Commons Attribution-Non-Commercial, a cheadaíonn an úsáid, an dáileadh agus an atáirgeadh in aon mheán, fad is nach chun críche tráchtála atá an úsáid deiridh agus gurb é an bunphrionsabal go bhfuil an saothar bunaidh ceart. Tagairt.
Nóta: Ní iarrann muid ort ach do sheoladh ríomhphoist a sholáthar ionas go mbeidh a fhios ag an duine a mholann tú don leathanach gur mian leat go bhfeicfidís an ríomhphost agus nach turscar é. Ní ghabhfaimid aon seoltaí ríomhphoist.
Úsáidtear an cheist seo chun tástáil a dhéanamh an cuairteoir thú agus chun cosc ​​a chur ar chur isteach turscair uathoibríoch.
Le E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Léirigh anailís phróitéomach ar néaróin mhífheidhmiúla go ngníomhaítear cláir meitibileacha chun dul i ngleic le néar-dhíghiniúint.
Le E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Léirigh anailís phróitéomach ar néaróin mhífheidhmiúla go ngníomhaítear cláir meitibileacha chun dul i ngleic le néar-dhíghiniúint.
©2020 Cumann Meiriceánach um Chur Chun Cinn na hEolaíochta. gach ceart ar cosaint. Tá AAAS ina chomhpháirtí de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. EolaíochtAdvances ISSN 2375-2548.