Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun na torthaí is fearr a fháil, molaimid duit leagan níos nuaí de do bhrabhsálaí a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, táimid ag taispeáint an tsuímh gan stíl ná JavaScript.
Úsáidtear aigéad propónach (PPA) chun ról mhífheidhm mitochondrial i neamhoird néarfhorbartha amhail neamhord speictrim uathachais a staidéar. Is eol go gcuireann PPA isteach ar bhithghineas, meitibileacht agus láimhdeachas mitochondrial. Mar sin féin, tá fadhbanna fós ag baint le héifeachtaí PPA ar dhinimic, scoilteadh agus comhleá mitochondrial mar gheall ar nádúr casta ama na meicníochtaí seo. Anseo, úsáidimid teicnící íomháithe cainníochtúla comhlántacha chun imscrúdú a dhéanamh ar an gcaoi a mbíonn tionchar ag PPA ar ultrastruchtúr, moirfeolaíocht agus dinimic mitochondrial i gcealla SH-SY5Y cosúil le néaróin. Ba chúis le PPA (5 mM) laghdú suntasach ar achar mitochondrial (p < 0.01), trastomhas agus imlíne an fheirit (p < 0.05), agus achar 2 (p < 0.01). Léirigh anailís aimsitheora imeachtaí mitochondrial méadú suntasach (p < 0.05) in imeachtaí scoilteadh agus comhleá, rud a choinníonn sláine an líonra mitochondrial faoi choinníollacha struis. Ina theannta sin, laghdaíodh go suntasach léiriú mRNA cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) agus OPA1 (p < 0.05). 01). Léiríonn sé seo athmhúnlú mhórfhoirmiú, bithghinéis agus dinimic mitochondrial chun feidhm a choinneáil faoi dhálaí struis. Soláthraíonn ár sonraí léargas nua ar éifeachtaí PPA ar dhinimic mitochondrial agus leagann siad béim ar úsáideacht teicnící íomháithe chun na meicníochtaí rialála casta a bhaineann le freagairtí struis mitochondrial a staidéar.
Tá ról lárnach ag mitochondria i réimse feidhmeanna ceallacha thar a róil tipiciúla i dtáirgeadh fuinnimh agus i mbiosintéis. Is rialtóir ríthábhachtach é meitibileacht mitochondrial maidir le comharthaíocht cailciam, homeostasis meitibileach agus ocsaídiúcháin-laghdaithe, comharthaíocht athlastach, modhnuithe eipiginéiteacha, iomadú cille, difreáil agus bás cille cláraithe1. Go háirithe, tá meitibileacht mitochondrial ríthábhachtach d’fhorbairt, marthanacht agus feidhm néarónach agus tá baint fhorleathan aige le léirithe éagsúla néarapaiteolaíochta2,3,4.
Le deich mbliana anuas, tá stádas meitibileach tagtha chun cinn mar rialtóir lárnach néarghineasais, difreála, aibithe agus plaisteachta5,6. Le déanaí, tá moirfeolaíocht agus dinimic mitochondrial anois ina gcomhpháirteanna thar a bheith tábhachtach de mhiotóis, próiseas dinimiciúil a chothaíonn linn snámha mitochondrial sláintiúla laistigh de chealla. Rialaítear dinimic mitochondrial le conairí casta idirspleácha ó bhithghineas agus bithfhuinneamh mitochondrial go scoilteadh, comhleá, iompar agus imréiteach mitochondrial7,8. Cuireann cur isteach ar aon cheann de na meicníochtaí comhtháite seo isteach ar chothabháil líonraí mitochondrial sláintiúla agus tá iarmhairtí feidhmiúla móra aige maidir le néarfhorbairt9,10. Go deimhin, breathnaítear mírialú dinimic mitochondrial i go leor neamhoird shíciatracha, néar-dhíghiniúna agus néar-fhorbartha, lena n-áirítear neamhoird speictrim uathachais (NSU)11,12.
Is neamhord néarfhorbartha ilchineálach é ASD a bhfuil ailtireacht ghéiniteach agus eipigéiniteach chasta aige. Níl aon cheist faoi oidhreachtúlacht ASD, ach níl mórán tuisceana fós ar an etiology mhóilíneach atá mar bhunús leis. Soláthraíonn sonraí a charnadh ó mhúnlaí réamhchliniciúla, staidéir chliniciúla, agus tacair sonraí móilíneacha il-ómacha fianaise mhéadaitheach ar mhífheidhm mitochondrial in ASD13,14. Rinneamar scagadh meitileála DNA ar fud an ghéanóim roimhe seo i gcohórt othar le ASD agus shainaithin muid géinte a bhí meitilithe go difriúil feadh conairí meitibileacha mitochondrial15. Ina dhiaidh sin, thuairiscigh muid meitileáil difreálach rialtóirí lárnacha bithghineas agus dinimic mitochondrial, a bhí bainteach le líon méadaithe cóipeanna mtDNA agus próifíl meitibileach fuail athraithe in ASD16. Soláthraíonn ár sonraí fianaise mhéadaitheach go bhfuil ról lárnach ag dinimic mitochondrial agus homeostasis i bpaitifiseolaíocht ASD. Dá bhrí sin, is príomhsprioc den taighde leanúnach ar ghalair néareolaíocha arb iad is sainairíonna mífheidhm mitochondrial tánaisteach a fheabhsú.
Is minic a úsáidtear teicnící móilíneacha chun ról géinte sonracha i bhfreagairtí struis mitochondrial a staidéar. Mar sin féin, d'fhéadfadh an cur chuige seo a bheith teoranta ag nádúr ilghnéitheach agus sealadach na meicníochtaí rialaithe miotóiseacha. Thairis sin, is táscaire indíreach ar athruithe feidhmiúla é léiriú difreálach géinte mitochondrial, go háirithe ós rud é nach ndéantar ach líon teoranta géinte a anailísiú de ghnáth. Dá bhrí sin, tá modhanna níos dírí molta chun feidhm mitochondrial agus bithfhuinneamh a staidéar17. Tá moirfeolaíocht mitochondrial dlúthbhainteach le dinimic mitochondrial. Tá cruth, nascacht agus struchtúr mitochondrial ríthábhachtach maidir le táirgeadh fuinnimh agus marthanacht mitochondrial agus cille5,18. Thairis sin, díríonn comhpháirteanna éagsúla mitosis ar athruithe i moirfeolaíocht mitochondrial, a d'fhéadfadh a bheith ina gcríochphointí úsáideacha maidir le mífheidhm mitochondrial agus bunús a sholáthar do staidéir mheicniúla ina dhiaidh sin.
Is féidir moirfeolaíocht mitochondrial a bhreathnú go díreach ag baint úsáide as micreascópacht leictreon tarchurtha (TEM), rud a chuireann ar chumas staidéar mionsonraithe a dhéanamh ar ultrastruchtúr ceallach. Léiríonn TEM go díreach moirfeolaíocht, cruth agus struchtúr cristae mitochondrial ag réiteach mitochondria aonair, seachas brath go hiomlán ar thrascríobh géine, léiriú próitéine nó paraiméadair fheidhmiúla mitochondrial i ndaonraí cealla17,19,20. Ina theannta sin, éascaíonn TEM staidéar ar idirghníomhaíochtaí idir mitochondria agus orgánailí eile, amhail an reitineal endoplasmach agus autofagosóim, a bhfuil róil thábhachtacha acu i bhfeidhm mitochondrial agus homeostasis21,22. Dá bhrí sin, déanann sé seo TEM ina phointe tosaigh maith chun mífheidhm mitochondrial a staidéar sula ndírítear ar chonairí nó géinte sonracha. De réir mar a éiríonn feidhm mitochondrial níos ábhartha don néarapaiteolaíocht, tá gá soiléir ann a bheith in ann moirfeolaíocht agus dinimic mitochondrial a staidéar go díreach agus go cainníochtúil i samhlacha néarónach in vitro.
San alt seo, scrúdaímid dinimic mitochondrial i samhail néarónach de mhífheidhm mitochondrial i neamhord speictrim uathachais. Thuairiscigh muid roimhe seo meitiliú difreálach carbocsaileáis béite propionyl-CoA (PCCB) in ASD15, fo-aonad den einsím mitochondrial propionyl-CoA carbocsaileáis PCC. Is eol go mbíonn carnadh tocsaineach díorthach propionyl, lena n-áirítear aigéad propónach (PPA) mar thoradh ar mhírialú PCC23,24,25. Tá sé léirithe go gcuireann PPA isteach ar mheitibileacht néarónach agus go n-athraíonn sé iompar in vivo agus is samhail ainmhíoch seanbhunaithe é chun meicníochtaí néarfhorbartha atá bainteach le ASD26,27,28 a staidéar. Ina theannta sin, tá tuairiscí ann go gcuireann PPA isteach ar acmhainneacht membrane mitochondrial, ar bhithghineas agus ar riospráid in vitro agus úsáidtear go forleathan é chun mífheidhm mitochondrial i néaróin a shamhaltú29,30. Mar sin féin, níl mórán tuisceana fós ar thionchar mhífheidhm mitochondrial spreagtha ag PPA ar mhórfhoirmiú agus dinimic mitochondrial.
Úsáideann an staidéar seo teicnící íomháithe comhlántacha chun éifeachtaí PPA ar mhórfhoirmiú, dinimic agus feidhm mitochondrial i gcealla SH-SY5Y a chainníochtú. Ar dtús, d'fhorbraíomar modh TEM chun athruithe i mórfhoirmiú agus ultrastruchtúr mitochondrial a shamhlú17,31,32. I bhfianaise nádúr dinimiciúil na mitochondria33, d'úsáideamar anailís logánaitheora imeachtaí mitochondrial (MEL) freisin chun athruithe sa chothromaíocht idir imeachtaí scoilte agus comhleá, líon agus toirt mitochondrial faoi strus PPA a chainníochtú. Ar deireadh, rinneamar scrúdú ar cibé an bhfuil mórfhoirmiú agus dinimic mitochondrial bainteach le hathruithe i léiriú géinte atá bainteach le bithghinéis, scoilteadh agus comhleá. Le chéile, léiríonn ár sonraí an dúshlán a bhaineann le castacht na meicníochtaí a rialaíonn dinimic mitochondrial a shoiléiriú. Leagaimid béim ar úsáideacht TEM i staidéar a dhéanamh ar mhórfhoirmiú mitochondrial mar chríochphointe intomhaiste comhtháite mitosis i gcealla SH-SY5Y. Ina theannta sin, leagaimid béim ar an bhfíric go soláthraíonn sonraí TEM an fhaisnéis is saibhre nuair a chuirtear le chéile iad le teicnící íomháithe a ghabhann imeachtaí dinimiciúla mar fhreagairt ar strus meitibileach. Féadfaidh tuilleadh tréithrithe ar na meicníochtaí rialála móilíneacha a thacaíonn le mitosis cealla néarónach léargas tábhachtach a sholáthar ar chomhpháirt mitochondrial an néarchórais agus ar ghalair néar-dhíghiniúna.
Chun strus mitochondrial a spreagadh, rinneadh cealla SH-SY5Y a chóireáil le PPA ag baint úsáide as própónáit sóidiam (NaP) 3 mM agus 5 mM. Roimh TEM, rinneadh ullmhúchán crióigineach ar na samplaí ag baint úsáide as reo ardbhrú agus reo (Fíor 1a). D'fhorbraíomar píblíne anailíse íomhá mitochondrial uathoibrithe chun ocht bparaiméadar moirfeolaíoch de dhaonraí mitochondrial a thomhas thar thrí mhacasamhlú bitheolaíoch. Fuaireamar amach gur athraigh cóireáil PPA ceithre pharaiméadar go suntasach: achar 2, achar, imlíne, agus trastomhas Feret (Fíor 1b–e). Laghdaigh Achar 2 go suntasach le cóireáil PPA 3 mM agus 5 mM araon (p = 0.0183 agus p = 0.002, faoi seach) (Fíor 1b), agus laghdaigh achar (p = 0.003), imlíne (p = 0.0106) agus trastomhas Feret go suntasach. Bhí laghdú suntasach (p = 0.0172) sa ghrúpa cóireála 5 mM i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (Fíor 1c–e). Léirigh laghduithe suntasacha ar achar agus imlíne go raibh mitochondria níos lú agus níos cruinne ag cealla a ndearnadh cóireáil orthu le 5 mM PPA, agus nach raibh na mitochondria seo chomh fada agus a bhí siad sna cealla rialaithe. Tá sé seo comhsheasmhach freisin le laghdú suntasach ar thrastomhas Feret, paraiméadar neamhspleách a léiríonn laghdú ar an achar is mó idir imill na gcáithníní. Breathnaíodh athruithe in ultrastruchtúr na cristae: tháinig laghdú ar na cristae faoi thionchar strus PPA (Fíor 1a, painéal B). Mar sin féin, níor léirigh gach íomhá ultrastruchtúr na cristae go soiléir, mar sin níor rinneadh anailís chainníochtúil ar na hathruithe seo. Féadfaidh na sonraí TEM seo trí chás féideartha a léiriú: (1) feabhsaíonn PPA scoilteadh nó cuireann sé cosc ​​​​ar chomhleá, rud a fhágann go laghdaíonn mitochondria atá ann cheana féin i méid; (2) cruthaíonn bithghinéis fheabhsaithe mitochondria nua, níos lú nó (3) spreagann sé an dá mheicníocht ag an am céanna. Cé nach féidir na coinníollacha seo a idirdhealú le TEM, léiríonn athruithe moirfeolaíocha suntasacha athruithe i homeostasis agus dinimic mitochondrial faoi strus PPA. Ina dhiaidh sin rinneamar iniúchadh ar pharaiméadair bhreise chun na dinimic seo agus na meicníochtaí féideartha atá mar bhunús leo a thréithriú tuilleadh.
Athmhúnlaíonn aigéad propónach (PPA) moirfeolaíocht mitochondrial. (a) Íomhánna ionadaíocha de mhicreascópacht leictreon tarchuir (TEM) a léiríonn go laghdaíonn méid mitochondrial agus go n-éiríonn mitochondrial níos lú agus níos cruinne de réir mar a mhéadaíonn cóireáil PPA; 0 mM (gan chóireáil), 3 mM agus 5 mM, faoi seach. Léiríonn saigheada dearga mitochondria. (b–e) Ullmhaíodh cealla SH-SY5Y a ndearnadh cóireáil orthu le PPA ar feadh 24 uair an chloig le haghaidh TEM agus rinneadh anailís ar na torthaí ag baint úsáide as Fiji/ImageJ. Léirigh ceithre cinn de na hocht bparaiméadar difríochtaí suntasacha idir cealla rialaithe (gan chóireáil, 0 mM PPA) agus cealla cóireáilte (3 mM agus 5 mM PPA). (b) Réigiún 2, (c) Achar, (d) Imlíne, (e) Trastomhas an fheora. Baineadh úsáid as anailís aontreo ar athraitheas (rialú vs. cóireáil) agus tástáil ilchomparáide Dunnett chun difríochtaí suntasacha a chinneadh (p <0.05). Léiríonn pointí sonraí an meánluach mitochondrial do gach cill aonair, agus léiríonn barraí earráide an meán ± SEM. Léiríonn na sonraí a thaispeántar n = 3, 24 chill ar a laghad in aghaidh an mhacasamhail; rinneadh anailís ar 266 íomhá san iomlán; Léiríonn * p < 0.05, léiríonn ** p < 0.01.
Chun cur síos breise a dhéanamh ar an gcaoi a bhfreagraíonn dinimic mitochondrial do PPA, dhaitear mitochondria le heistir eitile teitreameitilrhodamíne (TMRE) agus úsáideadh micreascópacht am-imeachta agus anailís MEL chun mitochondria a aimsiú agus a chainníochtú tar éis 24 uair an chloig ag PPA 3 agus 5 mM. Cóireáil imeachtaí scoilte agus comhleá. (Fíor 2a). Tar éis anailíse MEL, rinneadh anailís bhreise ar mitochondria chun líon na struchtúr mitochondrial agus a meántoirt a chainníochtú. Thugamar faoi deara méadú beag ach suntasach ar líon na n-imeachtaí scoilte a tharla ag 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] i gcomparáid le himeachtaí scoilte [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] agus comhleá [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] agus comhleá [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] go suntasach ag 5 mM i gcomparáid leis an rialú (Fíor 3b). Mhéadaigh líon na mitochondria go suntasach ag 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] agus 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] araon (Fíor 3c), agus níor athraigh meántoirt gach struchtúir mitochondrial (Fíor 3c). 3d). Le chéile, tugann sé seo le fios go bhfeidhmíonn athmhúnlú dinimic mitochondrial mar fhreagairt chúitimh a chothaíonn sláine an líonra mitochondrial go rathúil. Tugann an méadú ar líon na n-imeachtaí scoilte ag PPA 3 mM le fios go bhfuil an méadú ar líon mitochondrial mar gheall ar scoilteadh mitochondrial go páirteach, ach ós rud é go bhfanann an meántoirt mitochondrial gan athrú go bunúsach, ní féidir bithghineas a chur as an áireamh mar fhreagairt chúitimh bhreise. Mar sin féin, tá na sonraí seo comhsheasmhach leis na struchtúir mitochondrial níos lú, cruinne a breathnaíodh le TEM agus léiríonn siad freisin athruithe suntasacha i ndinimic mitochondrial a spreag PPA.
Spreagann aigéad propónach (PPA) athmhúnlú mitochondrial dinimiciúil chun sláine an líonra a choinneáil. Rinneadh cealla SH-SY5Y a shaothrú, a chóireáil le PPA 3 agus 5 mM ar feadh 24 uair an chloig agus a dhaite le TMRE agus Hoechst 33342 agus ina dhiaidh sin rinneadh anailís MEL. (a) Íomhánna micreascópachta ama-imeachta ionadaíocha a léiríonn dath agus teilgin uas-déine dénártha ag am 2 (t2) do gach coinníoll. Feabhsaítear réigiúin roghnaithe a léirítear i ngach íomhá dénártha agus taispeántar iad i 3D ag trí fhráma ama éagsúla (t1-t3) chun an dinimic le himeacht ama a léiriú; tá imeachtaí comhleá aibhsithe i nglas; tá imeachtaí scoilte aibhsithe i nglas. Taispeántar i ndearg iad. (b) Meánlíon na n-imeachtaí dinimiciúla in aghaidh an choinníll. (c) Meánlíon na struchtúr mitochondrial in aghaidh na cille. (d) Meántoirt (µm3) de gach struchtúr mitochondrial in aghaidh na cille. Tá na sonraí a thaispeántar ionadaíoch do n = 15 chill in aghaidh an ghrúpa cóireála. Léiríonn na barraí earráide a thaispeántar meán ± SEM, barra scála = 10 μm, * p < 0.05.
Is cúis le cosc ​​trascríobh géinte a bhaineann le dinimic mitochondrial é aigéad propónach (PPA). Rinneadh cealla SH-SY5Y a chóireáil le PPA 3 agus 5 mM ar feadh 24 uair an chloig. Rinneadh cainníochtú géine coibhneasta ag baint úsáide as RT-qPCR agus rinneadh é a normalú go B2M. Géinte bithghinéis mitochondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 agus (d) NFE2L2. Géinte comhleá agus scoilte mitochondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 agus (i) DRP1. Rinneadh tástáil ar dhifríochtaí suntasacha (p < 0.05) ag baint úsáide as ANOVA aontreo (rialú vs. cóireáil) agus tástáil ilchomparáide Dunnett: léiríonn * p < 0.05, léiríonn ** p < 0.01, agus léiríonn **** p < 0.0001. Léiríonn barraí meánléiriú ± SEM. Léiríonn na sonraí a thaispeántar macasamhla bitheolaíocha n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), agus n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Léiríonn sonraí ó anailísí TEM agus MEL le chéile go n-athraíonn PPA moirfeolaíocht agus dinimic mitochondrial. Mar sin féin, ní thugann na teicnící íomháithe seo léargas ar na meicníochtaí bunúsacha a thiomáineann na próisis seo. Dá bhrí sin, rinneamar scrúdú ar léiriú mRNA naoi rialtóir lárnacha ar dhinimic mitochondrial, bithghinéis, agus mitosis mar fhreagairt ar chóireáil PPA. Rinneamar cainníochtú ar oncogene myeloma cille (cMYC), fachtóir riospráide núicléach (NRF1), fachtóir trascríobh mitochondrial 1 (TFAM), fachtóir trascríobh cosúil le NFE2 BZIP (NFE2L2), próitéin cosúil le gastrin 2 (STOML2), atrophy néaróg optúil 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) agus próitéin ghaolmhar le dynamin 1 (DRP1) tar éis 24 uair an chloig de chóireáil le PPA 3 mM agus 5 mM. Breathnaíodh cóireáil PPA 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 agus p < 0.0001, faoi seach) agus 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (Fíor 3a–c). Bhí an laghdú ar léiriú mRNA ag brath ar an dáileog: laghdaigh léiriú cMYC, NRF1 agus TFAM 5.7, 2.6 agus 1.9 uair ag 3 mM, faoi seach, agus 11.2, 3 agus 2.2 uair ag 5 mM. I gcodarsnacht leis sin, níor athraíodh an géin lárnach bithghinéis réadócs NFE2L2 ag aon tiúchan PPA, cé gur breathnaíodh treocht dáileog-spleách den chineál céanna maidir le laghdú ar léiriú (Fíor 3d).
Rinneamar scrúdú freisin ar léiriú géinte clasaiceacha a bhfuil baint acu le rialáil na scoilte agus an chomhleá. Meastar go bhfuil baint ag STOML2 le comhleá, miotafagas agus bithghinéis, agus laghdaíodh a léiriú go suntasach (p < 0.0001) faoi 3 mM (athrú 2.4 oiread) agus 5 mM (athrú 2.8 oiread) PPA (Fíor 1). 3d). Ar an gcaoi chéanna, laghdaíodh léiriú géine chomhleá OPA1 ag 3 mM (athrú 1.6 oiread) agus 5 mM (athrú 1.9 oiread) PPA (p = 0.006 agus p = 0.0024, faoi seach) (Fíor 3f). Mar sin féin, ní bhfuaireamar difríochtaí suntasacha i léiriú géinte chomhleá MFN1, MFN2 nó géine scoilte DRP1 faoi strus PPA 24 uair an chloig (Fíor 3g–i). Ina theannta sin, fuarthas amach nár athraigh leibhéil ceithre phróitéin chomhleá agus scoilte (OPA1, MFN1, MFN2 agus DRP1) faoi na coinníollacha céanna (Fíor 4a–d). Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara go léiríonn na sonraí seo pointe amháin in am agus nach léiríonn siad athruithe i léiriú próitéine nó leibhéil ghníomhaíochta le linn céimeanna luatha strus PPA. Mar sin féin, léiríonn laghduithe suntasacha i léiriú cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, agus OPA1 mírialú suntasach trascríobh ar mheitibileacht, bithghineas agus dinimic mitochondrial. Ina theannta sin, leagann na sonraí seo béim ar úsáideacht teicnící íomháithe chun athruithe deiridh i bhfeidhm mitochondrial a staidéar go díreach.
Níor athraigh leibhéil próitéine an fhachtóra chomhleá agus scoilte tar éis cóireála le haigéad propónach (PPA). Rinneadh cealla SH-SY5Y a chóireáil le PPA 3 agus 5 mM ar feadh 24 uair an chloig. Rinneadh leibhéil próitéine a chainníochtú trí anailís blot Western, agus rinneadh leibhéil léirithe a normalú go dtí an próitéin iomlán. Taispeántar meánléiriú próitéine agus blotanna Western ionadaíocha den phróitéin sprice agus den phróitéin iomlán. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Léiríonn na barraí meán ± SEM, agus tá na sonraí a thaispeántar ionadaíoch do n = 3 mhacasamhlú bitheolaíoch. Rinneadh ilchompáráidí (p < 0.05) ag baint úsáide as anailís aonbhealaigh ar athraitheas agus tástáil Dunnett. Taispeántar an glóthach agus an blot bunaidh i bhFíor S1.
Tá mífheidhm mitochondrial bainteach le galair ilchórais ó ghalair meitibileacha, cardashoithíoch agus matánacha go galair néareolaíocha1,10. Tá go leor galair néar-dhíghiniúna agus néar-dhíghiniúna bainteach le mífheidhm mitochondrial, rud a aibhsíonn an tábhacht a bhaineann leis na horgánailí seo ar feadh shaolré na hinchinne. I measc na ngalar seo tá galar Pháircinsin, galar Alzheimer agus ASD3,4,18. Mar sin féin, tá sé deacair rochtain a fháil ar fhíochán inchinne chun na galair seo a staidéar, go háirithe ag an leibhéal meicníoch, rud a fhágann gur rogha eile riachtanach iad córais mhúnla ceallacha. Sa staidéar seo, úsáidimid córas mhúnla ceallach ag baint úsáide as cealla SH-SY5Y atá cóireáilte le PPA chun an mhífheidhm mitochondrial a breathnaíodh i ngalair néarónacha, go háirithe neamhoird speictrim uathachais, a athchruthú. D’fhéadfadh léargas a bheith ann ar eitiolaíocht ASD trí úsáid a bhaint as an tsamhail PPA seo chun dinimic mitochondrial i néaróin a staidéar.
Rinneamar iniúchadh ar an bhféidearthacht TEM a úsáid chun athruithe i moirfeolaíocht mitochondrial a fheiceáil. Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara go gcaithfear TEM a úsáid i gceart chun a éifeachtúlacht a uasmhéadú. Ligeann ullmhú crió-shamplaí caomhnú níos fearr a dhéanamh ar struchtúir néarónacha trí chomhpháirteanna ceallacha a shocrú ag an am céanna agus foirmiú artifacts a laghdú34. Ag teacht leis seo, thugamar faoi deara go raibh orgánailí fo-cheallacha slána agus mitochondria fadaithe ag cealla SH-SY5Y cosúil le néaróin (Fíor 1a). Leagann sé seo béim ar úsáideacht teicnící ullmhúcháin crióigineacha chun moirfeolaíocht mitochondrial a staidéar i samhlacha cealla néarónacha. Cé go bhfuil tomhais chainníochtúla ríthábhachtach chun anailís oibiachtúil a dhéanamh ar shonraí TEM, níl aon chomhdhearcadh ann fós maidir leis na paraiméadair shonracha ba chóir a thomhas chun athruithe moirfeolaíocha mitochondrial a dhearbhú. Bunaithe ar líon mór staidéar a rinne scrúdú cainníochtúil ar mhoirfeolaíocht mitochondrial17,31,32, d'fhorbraíomar píblíne anailíse íomhá mitochondrial uathoibrithe a thomhaiseann ocht bparaiméadar moirfeolaíoch, eadhon: achar, achar2, cóimheas gné, imlíne, ciorclú, céim, trastomhas Feret agus cruinneas.
Ina measc, laghdaigh PPA achar 2, achar, imlíne, agus trastomhas Feret go suntasach (Fíor 1b–e). Léirigh sé seo gur tháinig laghdú agus gur éirigh mitochondria níos lú agus níos cruinne, rud atá comhsheasmhach le staidéir roimhe seo a léirigh laghdú ar achar mitochondrial tar éis 72 uair an chloig de strus mitochondrial spreagtha ag PPA30. Féadfaidh na gnéithe moirfeolaíocha seo a léiriú go bhfuil scoilteadh mitochondrial ann, próiseas riachtanach chun comhpháirteanna damáiste a scaradh ón líonra mitochondrial chun a ndíghrádú a chur chun cinn trí mitophagy35,36,37. Ar an láimh eile, d'fhéadfadh an laghdú ar mhéid mitochondrial meánach a bheith bainteach le méadú ar bhithghiniúint, rud a fhágann go bhfoirmítear mitochondria beaga nuabheirthe. Léiríonn scoilteadh nó bithghiniúint méadaithe freagairt chúitimh chun mitosis a choinneáil i gcoinne strus mitochondrial. Mar sin féin, ní féidir laghdú ar fhás mitochondrial, comhleá lagaithe, nó coinníollacha eile a eisiamh.
Cé go gceadaíonn na híomhánna ardtaifigh a chruthaítear le TEM cinneadh tréithe moirfeolaíocha ag leibhéal na mitochondria aonair, táirgeann an modh seo pictiúir dhéthoiseacha ag pointe amháin in am. Chun freagairtí dinimiciúla ar strus meitibileach a staidéar, dhaiteamar mitochondria le TMRE agus úsáideadh micreascópacht am-imeachta le hanailís MEL, rud a cheadaíonn léirshamhlú 3T ard-thráchta ar athruithe sa líonra mitochondrial le himeacht ama33,38. Thugamar faoi deara athruithe caolchúiseacha ach suntasacha i ndinimic mitochondrial faoi strus PPA (Fíor 2). Ag 3 mM, mhéadaigh líon na n-imeachtaí scoilte go suntasach, agus d'fhan na himeachtaí comhleá mar a chéile agus a bhí sa rialú. Breathnaíodh méadú ar líon na n-imeachtaí scoilte agus comhleá araon ag 5 mM PPA, ach bhí na hathruithe seo comhréireach go garbh, rud a thugann le fios go sroicheann cinéitic scoilte agus comhleá cothromaíocht ag tiúchain níos airde (Fíor 2b). D'fhan an meánmhéid mitochondrial gan athrú ag 3 agus 5 mM PPA araon, rud a léiríonn gur caomhnaíodh sláine an líonra mitochondrial (Fíor 2d). Léiríonn sé seo cumas líonraí mitochondrial dinimiciúla freagairt do strus meitibileach éadrom chun homeostasis a choinneáil go héifeachtach gan ilroinnt líonra a chur faoi deara. Ag 3 mM PPA, is leor an méadú ar scoilteadh chun aistriú chuig cothromaíocht nua a chur chun cinn, ach tá gá le hathmhúnlú cinéiteach níos doimhne mar fhreagairt ar strus a spreagann tiúchain níos airde de PPA.
Mhéadaigh líon na mitochondria ag an dá thiúchan struis PPA, ach níor athraigh an meánmhéid mitochondrial go suntasach (Fíor 2c). D’fhéadfadh sé seo a bheith mar gheall ar mhéadú ar bhithghiniúint nó méadú ar dheighilt; áfach, in éagmais laghdú suntasaí ar an meánmhéid mitochondrial, is dóichí go méadóidh bithshintéis. Mar sin féin, tacaíonn na sonraí i bhFíor 2 le dhá mheicníocht chúitimh a bheith ann: méadú ar líon na n-imeachtaí scoilte, atá comhsheasmhach le huasrialú scoilte mitochondrial, agus méadú ar líon na n-imeachtaí, atá comhsheasmhach le bhithghiniúint mitochondrial. Sa deireadh thiar, d’fhéadfadh cúiteamh dinimiciúil le haghaidh strus éadrom a bheith comhdhéanta de phróisis chomhuaineacha lena mbaineann scoilteadh, comhleá, bithghiniúint, agus mitophagy. Cé gur léirigh údair roimhe seo go bhfeabhsaíonn PPA mitosis30,39 agus mitophagy29, soláthraímid fianaise maidir le hathmhúnlú dinimic scoilte agus comhleá mitochondrial mar fhreagairt ar PPA. Deimhníonn na sonraí seo na hathruithe moirfeolaíocha a breathnaíodh le TEM agus tugann siad léargas breise ar na meicníochtaí a bhaineann le mífheidhm mitochondrial spreagtha ag PPA.
Ós rud é nár thug anailís TEM ná MEL fianaise dhíreach ar na meicníochtaí rialála géine a bhí mar bhunús leis na hathruithe moirfeolaíocha a breathnaíodh, scrúdaíomar léiriú RNA géinte atá bainteach le meitibileacht, bithghinéis agus dinimic mitochondrial. Is fachtóir trascríobh é an próta-oncogine cMYC atá bainteach le rialáil mitochondria, glicealáis, aimínaigéad agus aigéad sailleach40. Ina theannta sin, is eol go rialaíonn cMYC léiriú beagnach 600 géin mitochondrial atá bainteach le trascríobh, aistriúchán agus tionól casta mitochondrial, lena n-áirítear NRF1 agus TFAM41. Is dhá rialtóir lárnacha mitóise iad NRF1 agus TFAM, ag gníomhú síos an tsruth ó PGC-1α chun macasamhlú mtDNA a ghníomhachtú. Gníomhaítear an cosán seo trí chomharthaíocht cAMP agus AMPK agus tá sé íogair do chaiteachas fuinnimh agus do strus meitibileach. Scrúdaíomar freisin NFE2L2, rialtóir ocsaídiúcháin-laghdaithe de bhithghinéis mitochondrial, chun a chinneadh an bhféadfadh strus ocsaídiúcháin idirghabháil a dhéanamh i n-éifeachtaí PPA.
Cé nár athraigh léiriú NFE2L2, fuarthas laghdú comhsheasmhach dáileog-spleách ar léiriú cMYC, NRF1 agus TFAM tar éis 24 uair an chloig de chóireáil le 3 mM agus 5 mM PPA (Fíor 3a–c). Tuairiscíodh roimhe seo go raibh laghdú ar léiriú cMYC mar fhreagairt ar strus mitochondrial42, agus os a choinne sin, is féidir le laghdú ar léiriú cMYC mífheidhm mitochondrial a chur faoi deara trí mheitibileacht mitochondrial, nascacht líonra, agus polaraíocht membrane43 a athmhúnlú. Is suimiúil go bhfuil baint ag cMYC freisin le rialáil scoilteadh agus comhleá mitochondrial42,43 agus is eol go méadaíonn sé fosfaraileadh DRP1 agus logánú mitochondrial le linn deighilt cille44, chomh maith le hathmhúnlú moirfeolaíoch mitochondrial i gcealla gas néarónacha45. Go deimhin, taispeánann fibroblasts easnamhach i cMYC méid mitochondrial laghdaithe, rud a thagann le hathruithe a spreagtar ag strus PPA43. Léiríonn na sonraí seo caidreamh suimiúil ach nach bhfuil soiléir fós idir cMYC agus dinimic mitochondrial, rud a sholáthraíonn sprioc spéisiúil do staidéir amach anseo ar athmhúnlú de bharr struis PPA.
Tá laghdú NRF1 agus TFAM comhsheasmhach le ról cMYC mar ghníomhachtóir trascríobh tábhachtach. Tá na sonraí seo comhsheasmhach freisin le staidéir roimhe seo i gcealla ailse drólainne daonna a léirigh gur laghdaigh PPA léiriú mRNA NRF1 ag 22 uair an chloig, rud a bhí bainteach le hídiú ATP agus méadú ar ROS46. Thuairiscigh na húdair seo freisin gur mhéadaigh léiriú TFAM ag 8.5 uair an chloig ach gur fhill sé ar leibhéil bhunlíne ag 22 uair an chloig. I gcodarsnacht leis sin, léirigh Kim et al. (2019) go raibh laghdú suntasach tagtha ar léiriú mRNA TFAM tar éis 4 uair an chloig de strus PPA i gcealla SH-SY5Y; áfach, tar éis 72 uair an chloig, bhí méadú suntasach tagtha ar léiriú próitéine TFAM agus bhí méadú suntasach tagtha ar líon na gcóipeanna mtDNA. Dá bhrí sin, ní chuireann an laghdú ar líon na ngéinte bithghiniúna mitochondrial a breathnaíodh againn tar éis 24 uair an chloig as an áireamh an fhéidearthacht go bhfuil baint ag an méadú ar líon na mitochondrial le gníomhachtú bithghiniúna ag pointí ama níos luaithe. Léirigh staidéir roimhe seo go n-uasrialaíonn PPA mRNA agus próitéin PGC-1α go suntasach i gcealla SH-SY5Y ag 4 uair 30 nóiméad, agus go bhfeabhsaíonn aigéad propónach bithghinéis mitochondrial i heipiteacítí laonna trí PGC-1α ag 12 uair 39 nóiméad. Is suimiúil é nach rialtóir trascríobh díreach de NRF1 agus TFAM amháin é PGC-1α, ach tá sé léirithe freisin go rialaíonn sé gníomhaíocht MFN2 agus DRP1 trí eamhnú agus comhleá a rialáil47. Le chéile, leagann sé seo béim ar an dlúthcheangal idir meicníochtaí a rialaíonn freagairtí cúitimh mitochondrial a spreagann PPA. Thairis sin, léiríonn ár sonraí mírialú suntasach ar rialáil trascríobh bithghinéis agus meitibileachta faoi strus PPA.
Tá na géinte STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 agus DRP1 i measc na rialtóirí lárnacha ar scoilteadh, comhleá agus dinimic mitochondrial37,48,49. Tá go leor géinte eile bainteach le dinimic mitochondrial, áfach, thángthas ar ais roimhe seo go bhfuil STOML2, OPA1 agus MFN2 meitilithe go difriúil i gcohóirt ASD,16 agus tá roinnt staidéar neamhspleách tar éis athruithe sna fachtóirí trascríobh seo a thuairisciú mar fhreagairt ar strus mitochondrial50,51.52. Laghdaíodh léiriú OPA1 agus STOML2 araon go suntasach le cóireáil PPA 3 mM agus 5 mM (Fíor 3e, f). Tá OPA1 ar cheann de na rialtóirí clasaiceacha ar chomhleá mitochondrial trí idirghníomhaíocht dhíreach le MFN1 agus 2 agus tá ról aige in athmhúnlú cristae agus moirfeolaíocht mitochondrial53. Tá ról beacht STOML2 i ndinimic mitochondrial fós doiléir, ach tugann fianaise le fios go bhfuil ról aige i gcomhleá mitochondrial, bithghinéis, agus miotofaga.
Tá STOML2 páirteach i gcothabháil cúplála riospráide mitochondrial agus foirmiú coimpléisc slabhra riospráide54,55 agus tá sé léirithe go n-athraíonn sé tréithe meitibileacha cealla ailse go mór56. Léirigh staidéir go gcuireann STOML2 acmhainneacht membrane mitochondrial agus bithghineas chun cinn trí idirghníomhú le BAN agus cardiolipin 55, 57, 58. Ina theannta sin, léirigh staidéir neamhspleácha go rialaíonn an t-idirghníomhú idir STOML2 agus PINK1 mitofaga59,60. Is suntasach gur tuairiscíodh go n-idirghníomhaíonn STOML2 go díreach le MFN2 agus go gcobhsaíonn sé é agus go bhfuil ról tábhachtach aige freisin i gcobhsú isoforms fada OPA1 tríd an bpróitéáis atá freagrach as díghrádú OPA1 a chosc53,61,62. Féadfaidh an laghdú ar léiriú STOML2 a breathnaíodh in imoibrithe PPA na próitéiní comhleá seo a dhéanamh níos so-ghabhálaí i leith díghrádaithe trí chosáin atá ag brath ar ubiquitin agus próitéasóim48. Cé nach bhfuil ról beacht STOML2 agus OPA1 sa fhreagairt dhinimiciúil ar PPA soiléir, d’fhéadfadh laghdú ar léiriú na ngéinte comhleá seo (Fíor 3) cur isteach ar an gcothromaíocht idir scoilteadh agus comhleá agus laghdú ar mhéid mitochondrial a bheith mar thoradh air (Fíor 3). 1).
Ar an láimh eile, d'fhan léiriú próitéine OPA1 gan athrú tar éis 24 uair an chloig, agus níor athraigh leibhéil mRNA agus próitéine MFN1, MFN2 nó DRP1 go suntasach tar éis cóireála PPA (Fíor 3g-i, Fíor 4). D'fhéadfadh sé seo a léiriú nach bhfuil aon athruithe i rialáil na bhfachtóirí seo a bhfuil baint acu le comhleá agus scoilteadh mitochondrial. Mar sin féin, is fiú a thabhairt faoi deara go rialaítear gach ceann de na ceithre ghéin seo freisin le modhnuithe iar-thrí-scríobhacha (PTManna) a rialaíonn gníomhaíocht próitéine. Tá ocht malairt splice malartacha ag OPA1 a scoiltear go próitéalaíoch i mitochondria chun dhá isoform ar leith a tháirgeadh 63 . Cinneann an chothromaíocht idir isoforms fada agus gearra ról OPA1 i gcomhleá mitochondrial agus i gcothabháil an líonra mitochondrial 64 sa deireadh. Rialaítear gníomhaíocht DRP1 le fosfaraileadh próitéine kinase II atá ag brath ar chailciam/calmodulin (CaMKII), agus rialaítear díghrádú DRP1 le huibitíniú agus SUMOilation 65. Ar deireadh, is GTPáisí iad DRP1 agus MFN1/2 araon, mar sin d’fhéadfadh tionchar a bheith ag ráta táirgthe GTP i mitochondria 66 ar an ngníomhaíocht. Dá bhrí sin, cé go bhfanann léiriú na bpróitéiní seo tairiseach, ní fhéadfadh sé seo gníomhaíocht próitéine nó logánú gan athrú a léiriú 67,68. Go deimhin, is minic a fheidhmíonn stór próitéine PTM atá ann cheana mar an chéad líne chosanta atá freagrach as freagairtí struis ghéarmhíochaine a idirghabháil. I láthair struis meitibileach mheasartha inár samhail, is dócha go gcuireann PTM méadú ar ghníomhaíocht próitéiní comhleá agus scoilte chun cinn chun sláine mitochondrial a athbhunú go leordhóthanach gan gá le gníomhachtú breise na ngéinte seo ag leibhéal an mRNA nó an phróitéine.
Le chéile, leagann na sonraí thuas béim ar an rialáil chasta agus ama-spleách ar mhórfhoirmiú mitochondrial agus na dúshláin a bhaineann leis na meicníochtaí seo a shoiléiriú. Chun léiriú géine a staidéar, is gá ar dtús géinte sprice sonracha sa chonair a aithint. Mar sin féin, léiríonn ár sonraí nach bhfreagraíonn géinte sa chonair chéanna ar an mbealach céanna don strus céanna. Déanta na fírinne, léirigh staidéir roimhe seo gur féidir le géinte éagsúla sa chonair chéanna próifílí freagartha ama éagsúla a thaispeáint30,46. Ina theannta sin, tá meicníochtaí casta iar-thrascála ann a chuireann isteach ar an ngaol idir trascríobh agus feidhm géine. Is féidir le staidéir phróitéamacha léargas a thabhairt ar thionchar PTManna agus feidhm próitéine, ach cruthaíonn siad dúshláin freisin lena n-áirítear modhanna íseal-tréchur, cóimheasa arda comhartha-go-torann, agus droch-réiteach.
Sa chomhthéacs seo, tá acmhainneacht mhór ag baint le staidéar a dhéanamh ar mhórfhoirmiú mitochondrial ag baint úsáide as TEM agus MEL chun aghaidh a thabhairt ar cheisteanna bunúsacha faoin ngaol idir dinimic agus feidhm mitochondrial agus an chaoi a mbíonn tionchar aige seo ar ghalar. Thar aon rud eile, soláthraíonn TEM modh díreach chun mórfhoirmiú mitochondrial a thomhas mar phointe deiridh comhtháite de mhífheidhm agus dinimic mitochondrial51. Soláthraíonn MEL modh díreach freisin chun imeachtaí scoilte agus comhleá a shamhlú i dtimpeallacht cheallach tríthoiseach, rud a ligeann cainníochtú athmhúnlú mitochondrial dinimiciúil fiú mura mbíonn aon athruithe ar léiriú géine33. Anseo, leagaimid béim ar úsáideacht teicnící íomháithe mitochondrial i ngalair mitochondrial tánaisteacha. De ghnáth, is sainairíonna na galair seo strus meitibileach éadrom ainsealach arb iad is sainairíonna athmhúnlú caolchúiseach líonraí mitochondrial seachas damáiste géarmhíochaine mitochondrial. Mar sin féin, tá iarmhairtí feidhmiúla doimhne ag an cúiteamh mitochondrial is gá chun mitosis a choinneáil faoi strus ainsealach. I gcomhthéacs na néareolaíochta, féadfaidh tuiscint níos fearr ar na meicníochtaí cúitimh seo faisnéis thábhachtach a sholáthar faoin néarapaiteolaíocht pleiotropic a bhaineann le mífheidhm mitochondrial.
Sa deireadh thiar, leagann ár sonraí béim ar úsáideacht teicnící íomháithe chun tuiscint a fháil ar iarmhairtí feidhmiúla na n-idirghníomhaíochtaí casta idir léiriú géine, modhnuithe próitéine, agus gníomhaíocht próitéine a rialaíonn dinimic mitochondrial néarónach. Bhaineamar úsáid as PPA chun mífheidhm mitochondrial a shamhaltú i samhail cille néarónach chun léargas a fháil ar chomhpháirt mitochondrial ASD. Léirigh cealla SH-SY5Y a ndearnadh cóireáil orthu le PPA athruithe i moirfeolaíocht mitochondrial: tháinig mitochondria chun bheith beag agus cruinn, agus bhí cristae sainmhínithe go dona nuair a breathnaíodh iad le TEM. Léiríonn anailís MEL go dtarlaíonn na hathruithe seo ag an am céanna le méadú ar imeachtaí scoilte agus comhleá chun an líonra mitochondrial a choinneáil mar fhreagairt ar strus meitibileach éadrom. Thairis sin, cuireann PPA isteach go suntasach ar rialáil thrascríobh meitibileachta mitochondrial agus homeostasis. D'aithin muid cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, agus OPA1 mar rialtóirí mitochondrial tábhachtacha a chuireann strus PPA isteach orthu agus d'fhéadfadh ról a bheith acu i n-idirghabháil athruithe a spreagtar ag PPA i moirfeolaíocht agus feidhm mitochondrial. Tá gá le staidéir amach anseo chun athruithe ama a spreagtar ag PPA i léiriú géine agus i ngníomhaíocht próitéine, logánú, agus modhnuithe iar-aistriúcháin a shainiú níos fearr. Leagann ár sonraí béim ar chastacht agus ar idirspleáchas na meicníochtaí rialála a idirghabhálann an freagairt struis mitochondrial agus léiríonn siad úsáideacht TEM agus teicnící íomháithe eile le haghaidh staidéir mheicniúla níos spriocdhírithe.
Ceannaíodh an líne cille SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) ó Sigma-Aldrich. Fásadh cealla SH-SY5Y i meascán cothaitheach/meán cothaitheach F-12 modhnaithe Dulbecco's Eagle's (DMEM/F-12) agus L-glútamín (SC09411, ScienCell) i bhfleascáin 25 cm2 a raibh 20% séiream féatais bólachta (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) agus 1% peinicillin-streiptimícin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) curtha leo ag 37 °C, 5% CO2. Rinneadh fo-chultúr ar na cealla go dtí 80% comhshreabhadh ag baint úsáide as 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), rinneadh iad a lártheifneoiriú ag 300 g agus a phlátáil ag dlús de thart ar 7 × 105 cealla/ml. Rinneadh na turgnaimh uile ar chealla SH-SY5Y neamhdhifreáilte idir pasáistí 19–22. Riartar PPA mar NaP. Tuaslaig púdar NaP (Uimhir CAS 137-40-6, foirmle cheimiceach C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) in uisce te MilliQ go dtí tiúchan 1 M agus stóráil ag 4 °C. Ar lá na cóireála, caolaigh an tuaslagán seo le 1 M PPA go 3 mM agus 5 mM PPA i meán saor ó serum (DMEM/F-12 le L-glútamín). Ba iad na tiúchain chóireála do na turgnaimh uile ná gan aon PPA (0 mM, rialú), 3 mM, agus 5 mM PPA. Rinneadh na turgnaimh i dtrí mhacasamhlú bitheolaíocha ar a laghad.
Cuireadh cealla SH-SY5Y i bhfleascáin 25 cm5 ag ráta 5.5 × 105 cealla/ml agus fásadh iad ar feadh 24 uair an chloig. Cuireadh an chóireáil PPA leis an bhfleascán roimh 24 uair an chloig goradáin. Bailíodh millíní cealla de réir phrótacail fhochultúir fíocháin mamaigh gnáth (a thuairiscítear thuas). Athfhionraí an millín cealla i 100 µl 2.5% glútaraldehyde, 1× PBS agus stóráil ag 4 °C go dtí go ndearnadh próiseáil air. Lártheifneoiríodh cealla SH-SY5Y go hachomair chun na cealla a mhillíniú agus chun tuaslagán 2.5% glútaraldehyde, 1× PBS, a bhaint. Athfhionraí an dríodar i nglóthach agaróise 4% a ullmhaíodh in uisce driogtha (is é 1:1 an cóimheas idir an agaróis agus toirt an dríodair). Cuireadh píosaí agaróise ar ghreillí ar phlátaí cothroma agus brataíodh iad le 1-heicseadaicéin roimh reo faoi bhrú ard. Reoiteadh na samplaí in aicéatón 100% tirim ag -90°C ar feadh 24 uair an chloig. Ardaíodh an teocht ansin go -80°C agus cuireadh tuaslagán de 1% teitreacsóid osmium agus 0.1% glutaraldehyde leis. Stóráladh na samplaí ag -80°C ar feadh 24 uair an chloig. Ina dhiaidh sin, ardaíodh an teocht de réir a chéile go teocht an tseomra thar roinnt laethanta: ó – 80 °C go – 50 °C ar feadh 24 uair an chloig, go – 30 °C ar feadh 24 uair an chloig, go – 10 °C ar feadh 24 uair an chloig agus ar deireadh go teocht an tseomra.
Tar éis ullmhúcháin chrióigineacha, rinneadh na samplaí a thuiliú le roisín agus rinneadh codanna ultrathanaí (∼100 nm) ag baint úsáide as ultramhicríotóm Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Rinneadh na codanna a dhaiteadh le 2% aicéatáit úráinile agus citráit luaidhe. Breathnaíodh na samplaí ag baint úsáide as micreascóp leictreon tarchurtha FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (FEI roimhe seo), Eindhoven, an Ísiltír) ag feidhmiú ag 200 kV (tarchuradóir Lab6) agus ceamara CCD Gatan (Gatan, an Ríocht Aontaithe) a raibh scagaire fuinnimh Tridiem feistithe uirthi.
I ngach macasamhail theicniúil, fuarthas 24 íomhá cille aonair ar a laghad, le haghaidh 266 íomhá san iomlán. Rinneadh anailís ar na híomhánna uile ag baint úsáide as an macra Réigiún Spéise (ROI) agus an macra Mitochondria. Tá an macra miteochondria bunaithe ar mhodhanna foilsithe17,31,32 agus ceadaíonn sé próiseáil bhaisc leath-uathoibrithe d'íomhánna TEM i Fidsí/ImageJ69. Go hachomair: déantar an íomhá a inbhéartú agus a inbhéartú ag baint úsáide as dealú cúlra liathróide rollta (ga 60 picteilín) agus scagaire bandapaise FFT (ag baint úsáide as teorainneacha uachtaracha agus íochtaracha 60 agus 8 picteilín faoi seach) agus cosc ​​líne ingearach le lamháltas treoshuímh de 5%. Déantar tairseach uathoibríoch ar an íomhá phróiseáilte ag baint úsáide as algartam uasta entropy agus gintear masc dénártha. Baineadh réigiúin íomhá a bhaineann le ROIanna roghnaithe de láimh in íomhánna TEM amha, ag tréithriú miteochondria agus ag eisiamh an membrane plasma agus réigiúin ardchodarsnachta eile. I gcás gach ROI a baineadh amach, rinneadh anailís ar cháithníní dénártha níos mó ná 600 picteilín, agus tomhaiseadh achar na gcáithníní, imlíne, ais mhóra agus bheaga, trastomhas Feret, cruinneas agus ciorclaíocht ag baint úsáide as feidhmeanna tomhais ionsuite Fiji/ImageJ. Ag leanúint Merrill, Flippo, agus Strack (2017), ríomhadh achar 2, cóimheas gné na gcáithníní (cóimheas ais mhór go hais bheag), agus fachtóir crutha (FF) ó na sonraí seo, áit a bhfuil FF = imlíne 2/4pi x achar. Is féidir sainmhíniú na foirmle paraiméadraí a fháil i Merrill, Flippo, agus Strack (2017). Tá na macraí a luaitear ar fáil ar GitHub (féach Ráiteas Infhaighteachta Sonraí). Ar an meán, rinneadh anailís ar thart ar 5,600 cáithnín in aghaidh gach cóireála PPA, le haghaidh iomlán de thart ar 17,000 cáithnín (níor taispeánadh sonraí).
Cuireadh cealla SH-SH5Y i miasa cultúir 8-seomra (ThermoFisher, #155411) chun greamaitheacht a cheadú thar oíche agus ansin goradh iad le TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) agus Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Ruaimniú. Fuarthas íomhánna ag baint úsáide as léasair 405 nm agus 561 nm thar thimpeallacht 10 nóiméad, agus fuarthas íomhánna amha mar z-stacáin ina raibh 10 micreagraf íomhá le céim az de 0.2 μm idir frámaí íomhá ag 12 phointe ama ina dhiaidh sin. Bailíodh íomhánna ag baint úsáide as ardán sár-réitigh Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, an Ghearmáin) ag baint úsáide as lionsa LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Rinneadh anailís ar íomhánna in ImageJ ag baint úsáide as píblíne a thuairiscíodh roimhe seo agus an breiseán ImageJ chun imeachtaí comhleá agus scoilte, meánlíon struchtúr mitochondrial, agus meántoirt mitochondrial in aghaidh na cille a thomhas33. Tá macraí MEL ar fáil ar GitHub (féach Ráiteas Infhaighteachta Sonraí).
Fásadh cealla SH-SY5Y i plátaí sé-tholl ag dlús 0.3 × 106 cealla/mL ar feadh 24 uair an chloig roimh an gcóireáil. Baineadh RNA ag baint úsáide as an bprótacal Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) le mionathruithe: cuir 300 μl de mhaolán líse RNA le gach tobar roimh bhaint agus líse gach sampla mar chéim dheiridh le 30 μl d'uisce saor ó elution DNase/RNase. Seiceáladh gach sampla le haghaidh cainníochta agus cáilíochta ag baint úsáide as Speictreafótaiméadar UV-Vis NanoDrop ND-1000. Fuarthas próitéin iomlán ó lísáití cealla ag baint úsáide as 200 μl maolán líse RIPA, agus cainníochtaíodh tiúchan próitéine ag baint úsáide as measúnacht próitéine Bradford70.
Rinneadh sintéis cDNA ag baint úsáide as an Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) de réir threoracha an mhonaróra le roinnt modhnuithe. Sintéisíodh cDNA in imoibrithe 20-μl ag baint úsáide as 0.7 go 1 μg de RNA iomlán. Roghnaíodh tosaitheoirí ó pháipéir a foilsíodh roimhe seo 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tábla S1) agus dearadh na tóireadóirí tionlacain ag baint úsáide as an uirlis PrimerQuest ó Integrated DNA Technologies. Rinneadh na géinte uile a raibh spéis iontu a normalú don ghéin núicléach B2M. Tomhaiseadh léiriú géine STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC agus OPA1 le RT-qPCR. Áiríodh sa mháistir-mheascán polaiméaráis LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), tosaitheoirí ar aghaidh agus ar ais 10 μM, cDNA, agus uisce de ghrád PCR chun toirt deiridh de 10 μL a thabhairt do gach imoibriú. Tomhaiseadh léiriú géinte deighilte agus scoilte (DRP1, MFN1/2) ag baint úsáide as aistí ilphléacs TaqMan. Baineadh úsáid as Máistir-Mheascán Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) de réir threoracha an mhonaróra le mionathruithe. Áiríodh sa mháistir-mheascán ilphléacs RT-qPCR polaiméaráis LUNA Taq 1X, tosaitheoirí ar aghaidh agus ar ais 10 μM, tóireadóir 10 μM, cDNA, agus uisce de ghrád PCR, rud a eascraíonn i toirt deiridh de 20 μL do gach imoibriú. Rinneadh RT-qPCR ag baint úsáide as Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—uimhir sraitheach: R0618110). Taispeántar na coinníollacha timthriallta i dTábla S1. Rinneadh aimpliú ar na samplaí cDNA go léir faoi thrí agus gineadh cuar caighdeánach ag baint úsáide as sraith caoluithe deich n-uaire. Baineadh eisceachtaí i samplaí faoi thrí le diall caighdeánach tairsí timthrialla (Ct) >0.5 ón anailís chun in-atáirgtheacht sonraí a chinntiú30,72. Ríomhadh léiriú géine coibhneasta ag baint úsáide as an modh 2-ΔΔCt79.
Meascánaíodh samplaí próitéine (60 μg) le maolán luchtaithe Laemmli ag cóimheas 2:1 agus ritheadh ​​iad ar ghlóthach próitéine gan dath 12% (Bio-Rad #1610184). Aistríodh próitéiní chuig scannán PVDF (fluairíd polaivinilídéine) (#170-84156, Bio-Rad) ag baint úsáide as an gcóras Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Blocáladh an scannán agus goradh é leis na hantashubstaintí príomhúla cuí (OPA1, MFN1, MFN2, agus DRP1) (caolaithe 1:1000) ar feadh 48 uair an chloig, agus ina dhiaidh sin goradh é le hantashubstaintí tánaisteacha (1:10,000) ar feadh 1 uair an chloig. Ansin rinneadh íomháú ar na scannáin ag baint úsáide as Foshraith Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) agus taifeadadh iad ag baint úsáide as córas Bio-Rad ChemiDoc MP. Baineadh úsáid as ImageLab leagan 6.1 le haghaidh anailíse Western blot. Taispeántar an glóthach agus an blot bunaidh i bhFíor S1. Tá faisnéis faoi antashubstaintí ar fáil i dTábla S2.
Cuirtear tacair sonraí i láthair mar mheán agus earráid chaighdeánach an mheáin (SEM) trí shampla neamhspleácha ar a laghad. Rinneadh tástáil ar thacair sonraí le haghaidh gnáthachta ag baint úsáide as tástáil Shapiro-Wilks (mura luaitear a mhalairt) sula nglactar le dáileadh Gaussach agus diallais chaighdeánacha comhionanna agus sula ndeachaigh na hanailísí ar aghaidh. Chomh maith leis sin, rinneadh anailís ar an tacar sonraí ag baint úsáide as MEL LSD Fisher (p < 0.05), ANOVA aontreo (meán cóireála vs. meán rialaithe), agus tástáil ilchomparáide Dunnett chun suntasacht a chinneadh (p < 0.05). Taispeántar luachanna suntasacha p sa ghraf mar *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Rinneadh agus gineadh na hanailísí agus na graif staitistiúla go léir ag baint úsáide as GraphPad Prism 9.4.0.
Tá macraí Fiji/ImageJ le haghaidh anailíse íomhá TEM ar fáil go poiblí ar GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Tá an macra Mitochondrial Event Locator (MEL) ar fáil go poiblí ar GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM agus Vijaya A. Mitochondria: máistir-rialtóirí meitibileachta, homeostasis, strus, aosú agus eipiginéitic. Indinéisis. Eolaíocht Bhithleighis. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Mífheidhm ilghnéitheach mitochondrial i scitsifréine, casta I mar sprioc phaiteolaíoch féideartha. Scitsifréine. acmhainn. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. agus Beal, MF Mífheidhm mitochondrial i ngalar Pháircinsin. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG agus Mehta V. Mitochondria strusaithe: spriocanna ionraidh i ngalar Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF agus Ferreira GK Mitochondria agus an inchinn: bithfhuinneamh agus tuilleadh. Néaratocsainí. acmhainn. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Miteacoindrí pleiotrópacha: tionchar na miteacoindrí ar fhorbairt agus ar ghalar néarónach. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. agus Morais, VA Bithghinéis mhiotacondrial i néaróin: conas agus cá háit. idirnáisiúntacht. J. Mohr. an eolaíocht. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. agus Zhao, J. Rialáil dinimic mitochondrial mamaigh: deiseanna agus dúshláin. tosaigh. inchríneacha. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. agus Slack, RS Dinimic mitochondrial i rialáil néarghineasais: ón inchinn atá ag forbairt go dtí an inchinn fásta. forbairt. dinimic. 247, 47–53 (2018).