Tá an t-alt mar chuid den ábhar taighde “Feabhsú friotaíocht pischineálaigh i gcoinne pataiginí agus lotnaidí”, féach ar na 5 alt go léir.
Úsáideann an gníomhaire cúiseach atá leis an ngalar fungasach neacróis plandaí Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary straitéis il-shraitheach chun plandaí óstacha éagsúla a ionfhabhtú. Molann an staidéar seo úsáid an dé-aimín L-ornithine, aimínaigéad neamhphróitéine a spreagann sintéis aimínaigéid riachtanacha eile, mar straitéis bhainistíochta mhalartach chun freagairtí móilíneacha, fiseolaíocha agus bithcheimiceacha Phaseolus vulgaris L. ar mhúnla bán de bharr Pseudomonas sclerotiorum a fheabhsú. Léirigh turgnaimh in vitro gur chuir L-ornithine cosc ​​suntasach ar fhás mícéiliach S. pyrenoidosa ar bhealach dáileog-spleách. Thairis sin, d'fhéadfadh sé déine an mhúnla bháin a laghdú go suntasach faoi dhálaí cheaptha teasa. Ina theannta sin, spreag L-ornithine fás na bplandaí cóireáilte, rud a léiríonn nach raibh na tiúchain tástála de L-ornithine fíteatocsaineach do na plandaí cóireáilte. Ina theannta sin, fheabhsaigh L-ornithine léiriú frithocsaídeoirí neamh-einsímeacha (feinileacs agus flavonoidí intuaslagtha iomlána) agus frithocsaídeoirí einsímeacha (cataláis (CAT), peirocsaídáis (POX), agus polaifeanól-ocsaídáis (PPO)), agus mhéadaigh sé léiriú trí ghéin a bhaineann le frithocsaídeoirí (PvCAT1, PvSOD, agus PvGR). Ina theannta sin, nocht anailís in silico láithreacht próitéine oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) ionchasach i ngéanóm S. sclerotiorum, a bhí an-chosúil leis na próitéiní oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) de chuid Aspergillus fijiensis (AfOAH) agus Penicillium sp. (PlOAH) i dtéarmaí anailíse feidhmiúla, fearainn chaomhnaithe, agus toipeolaíochta. Is suimiúil é gur laghdaigh cur L-ornithine le meán brat deastróise prátaí (PDB) léiriú an ghéin SsOAH i mícéilia S. sclerotiorum go suntasach. Ar an gcaoi chéanna, laghdaigh cur i bhfeidhm eisgéineach L-ornithine léiriú an ghéin SsOAH go suntasach i mícéilia fungasach a bailíodh ó phlandaí cóireáilte. Ar deireadh, laghdaigh cur i bhfeidhm L-ornithine secretion aigéad ocsaileach go suntasach i meán PDB agus i nduilleoga ionfhabhtaithe araon. Mar fhocal scoir, tá ról lárnach ag L-ornithine i gcothabháil an stádais ocsaídiúcháin-laghdaithe chomh maith le freagairt chosanta plandaí ionfhabhtaithe a fheabhsú. D’fhéadfadh torthaí an staidéir seo cabhrú le modhanna nuálacha, atá neamhdhíobhálach don chomhshaol a fhorbairt chun múnla bán a rialú agus a thionchar ar tháirgeadh pónairí agus barra eile a mhaolú.
Is galar millteach a laghdaíonn toradh é an múnla bán, arb é an fungas neacratrófach Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary is cúis leis, agus is bagairt thromchúiseach é ar tháirgeadh domhanda pónairí (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Tá Sclerotinia sclerotiorum ar cheann de na pataiginí plandaí fungasacha is deacra a rialú, le raon óstach leathan de bhreis is 600 speiceas plandaí agus an cumas fíocháin óstacha a mhaolú go tapa ar bhealach neamhshonrach (Liang agus Rollins, 2018). Faoi dhálaí neamhfhabhracha, téann sé faoi chéim ríthábhachtach dá shaolré, ag fanacht díomhaoin ar feadh tréimhsí fada mar struchtúir dhubha, chrua, cosúil le síolta ar a dtugtar 'sclerotia' san ithir nó mar fhásanna bána, clúmhacha sa mhícéiliam nó i ngas na bplandaí ionfhabhtaithe (Schwartz et al., 2005). Tá S. sclerotiorum in ann sclerotia a fhoirmiú, rud a ligeann dó maireachtáil i bpáirceanna ionfhabhtaithe ar feadh tréimhsí fada ama agus leanúint ar aghaidh le linn galair (Schwartz et al., 2005). Tá sclerotia saibhir i gcothaithigh, is féidir leo maireachtáil san ithir ar feadh tréimhsí fada, agus feidhmiú mar an bpríomh-inoculum le haghaidh ionfhabhtuithe ina dhiaidh sin (Schwartz et al., 2005). Faoi choinníollacha fabhracha, péacann sclerotia agus táirgeann siad spóir san aer ar féidir leo gach cuid os cionn na talún den phlanda a ionfhabhtú, lena n-áirítear ach gan a bheith teoranta dóibh bláthanna, gais, nó pods (Schwartz et al., 2005).
Úsáideann Sclerotinia sclerotiorum straitéis ilchisealach chun a phlandaí óstacha a ionfhabhtú, lena n-áirítear sraith imeachtaí comhordaithe ó phéacadh sclerotial go forbairt comharthaí. Ar dtús, táirgeann S. sclerotiorum spóir ar fionraí (ar a dtugtar ascospóir) ó struchtúir cosúil le beacáin ar a dtugtar apothecia, a théann san aer agus a fhorbraíonn ina sclerotia neamhghluaiseachta ar smionagar plandaí ionfhabhtaithe (Bolton et al., 2006). Ansin scaoileann an fungas aigéad ocsaileach, fachtóir virulence, chun pH bhalla cealla plandaí a rialú, díghrádú einsímeach agus ionradh fíocháin a chur chun cinn (Hegedus agus Rimmer, 2005), agus pléascadh ocsaídiúcháin an phlanda óstach a chosc. Laghdaíonn an próiseas aigéadaithe seo balla cealla an phlanda, ag soláthar timpeallacht fhabhrach d'oibriú gnáth agus éifeachtach einsímí díghrádaithe balla cealla fungasacha (CWDEanna), rud a ligeann don phataigin an bac fisiceach a shárú agus dul isteach sna fíocháin óstacha (Marciano et al., 1983). Nuair a bhíonn sé treáite, scaoileann S. sclerotiorum roinnt CWDEanna, amhail polaigalacturonase agus ceallalase, a éascaíonn a scaipeadh i bhfíocháin ionfhabhtaithe agus a chuireann neacróis fíocháin faoi deara. Mar thoradh ar dhul chun cinn na ngort agus na mataí hífeacha, bíonn comharthaí tréithiúla an mhúnla bháin ann (Hegedus agus Rimmer, 2005). Idir an dá linn, aithníonn plandaí óstacha patrúin mhóilíneacha a bhaineann le pataiginí (PAMPanna) trí ghabhdóirí aitheantais patrún (PRRanna), rud a spreagann sraith imeachtaí comharthaíochta a ghníomhaíonn freagairtí cosanta sa deireadh.
In ainneoin blianta fada d’iarrachtaí chun galair a rialú, tá ganntanas leordhóthanach geirmphlasma frithsheasmhach i gcónaí i bpónairí, mar atá i mbarr tráchtála eile, mar gheall ar fhriotaíocht, marthanacht agus inoiriúnaitheacht an phataigin. Dá bhrí sin, tá bainistíocht galair thar a bheith dúshlánach agus éilíonn sé straitéis chomhtháite, ilghnéitheach lena n-áirítear meascán de chleachtais chultúrtha, rialú bitheolaíoch agus fungaicídí ceimiceacha (O'Sullivan et al., 2021). Is é rialú ceimiceach an mhúnla bháin an ceann is éifeachtaí toisc gur féidir le fungaicídí, nuair a chuirtear i bhfeidhm i gceart agus ag an am ceart iad, scaipeadh an ghalair a rialú go héifeachtach, déine an ionfhabhtaithe a laghdú agus caillteanais táirgeachta a íoslaghdú. Mar sin féin, is féidir le ró-úsáid agus ró-spleáchas ar fungaicídí teacht chun cinn cineálacha frithsheasmhacha de S. sclerotiorum agus drochthionchar a imirt ar orgánaigh neamhspriocdhírithe, ar shláinte ithreach agus ar cháilíocht uisce (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Dá bhrí sin, tá tosaíocht anois ag baint le roghanna malartacha atá neamhdhíobhálach don chomhshaol a aimsiú.
Is féidir le polaimíní (PAanna), amhail putrescine, spermidine, spermine, agus cadaverine, a bheith ina roghanna malartacha geallta i gcoinne pataiginí plandaí a fhaightear san ithir, rud a laghdaíonn úsáid fungaicídí ceimiceacha guaiseacha go hiomlán nó go páirteach (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). I bplandaí níos airde, bíonn PAanna páirteach i go leor próiseas fiseolaíoch lena n-áirítear, ach gan a bheith teoranta dóibh, deighilt cille, difreáil, agus freagairt do strusanna abhíotacha agus bitheacha (Killiny agus Nehela, 2020). Is féidir leo gníomhú mar fhrithocsaídeoirí, cabhrú le speicis ocsaigine imoibríocha (ROS) a bhailiú, homeostasis réadócs a chothabháil (Nehela agus Killiny, 2023), géinte a bhaineann le cosaint a spreagadh (Romero et al., 2018), conairí meitibileacha éagsúla a rialáil (Nehela agus Killiny, 2023), fíteahormóin intíre a mhodhnú (Nehela agus Killiny, 2019), friotaíocht chórasach faighte (SAR) a bhunú, agus idirghníomhaíochtaí plandaí-pataiginí a rialáil (Nehela agus Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Is fiú a thabhairt faoi deara go n-athraíonn na meicníochtaí agus na róil shonracha atá ag PAanna i gcosaint plandaí ag brath ar speicis plandaí, pataiginí, agus dálaí comhshaoil. Déantar an PA is flúirseach i bplandaí a bhithshintéisiú ón bpolaimín riachtanach L-ornithine (Killiny agus Nehela, 2020).
Tá ilróil ag L-ornithine i bhfás agus i bhforbairt plandaí. Mar shampla, léirigh staidéir roimhe seo go bhféadfadh ornithine a bheith bainteach le hathchúrsáil nítrigine (Liu et al., 2018), toradh, cáilíocht agus boladh ríse (Lu et al., 2020), agus freagairt struis uisce (Yang et al., 2000) i rís (Oryza sativa). Ina theannta sin, fheabhsaigh cur i bhfeidhm eisgéineach L-ornithine go suntasach an chaoinfhulaingt triomach i mbiatas siúcra (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) agus laghdaigh sé strus salainn i bplandaí oinniúin (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu agus Çavuşoǧlu, 2021) agus cnónna caisiú (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). D’fhéadfadh ról féideartha L-ornithine i gcosaint struis abhíotaigh a bheith mar gheall ar a rannpháirtíocht i gcarnadh próilín i bplandaí cóireáilte. Mar shampla, tuairiscíodh roimhe seo go bhfuil géinte a bhaineann le meitibileacht próilín, amhail géinte ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) agus próilín dehydrogenase (ProDH1 agus ProDH2), páirteach i gcosaint Nicotiana benthamiana agus Arabidopsis thaliana i gcoinne sraitheanna Pseudomonas syringae neamh-óstach (Senthil-Kumar agus Mysore, 2012). Ar an láimh eile, tá gá le dícharbocsaileáis ornithine fungasach (ODC) le haghaidh fás pataiginí (Singh et al., 2020). Mheabhsaigh spriocdhíriú ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici trí thostú géine spreagtha ag an óstach (HIGS) friotaíocht plandaí trátaí i gcoinne feoil Fusarium go suntasach (Singh et al., 2020). Mar sin féin, níor staidéar maith déanta ar ról féideartha chur i bhfeidhm eisgéineach ornithine i gcoinne strusanna bitheacha amhail fíteapatagáin. Níos tábhachtaí fós, níl mórán taighde déanta fós ar éifeachtaí ornithine ar fhriotaíocht galair agus na feiniméin bithcheimiceacha agus fiseolaíocha gaolmhara.
Tá sé tábhachtach tuiscint a fháil ar chastacht ionfhabhtú S. sclerotiorum i bplandaí léagúma chun straitéisí rialaithe éifeachtacha a fhorbairt. Sa staidéar seo, bhí sé mar aidhm againn ról féideartha an dé-aimín L-ornithine a aithint mar fhachtóir lárnach chun feabhas a chur ar mheicníochtaí cosanta agus ar fhriotaíocht plandaí léagúma i gcoinne ionfhabhtú Sclerotinia sclerotiorum. Déanaimid hipitéis, chomh maith le freagairtí cosanta plandaí ionfhabhtaithe a fheabhsú, go bhfuil ról lárnach ag L-ornithine freisin i gcothabháil an stádais ocsaídiúcháin-laghdaithe. Molaimid go bhfuil baint ag éifeachtaí féideartha L-ornithine le rialáil mheicníochtaí cosanta frithocsaídeacha einsímeacha agus neamh-einsímeacha agus cur isteach ar fhachtóirí pataigineachta/nimhiúlachta fungasacha agus próitéiní gaolmhara. Déanann an fheidhmiúlacht dhúbailte seo de L-ornithine iarrthóir gealladh fúthu le haghaidh straitéise inbhuanaithe chun tionchar an mhúnla bháin a mhaolú agus friotaíocht barra coitianta léagúma a fheabhsú i gcoinne an phataigin fungasach chumhachtaigh seo. D’fhéadfadh torthaí an staidéir seo cabhrú le modhanna nuálacha, atá neamhdhíobhálach don chomhshaol a fhorbairt chun múnla bán a rialú agus a thionchar ar tháirgeadh léagúma a mhaolú.
Sa staidéar seo, úsáideadh cineál tráchtála so-ghabhálach den phónaire coiteann, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), mar ábhar turgnamhach. Soláthraíodh síolta sláintiúla go cineálta ag an Roinn Taighde Pischineálaigh, Institiúid Taighde Barra Allamuigh (FCRI), Ionad Taighde Talmhaíochta (ARC), an Éigipt. Cuireadh cúig shíol i bpotaí plaisteacha (trastomhas istigh 35 cm, doimhneacht 50 cm) líonta le hithir atá ionfhabhtaithe le S. sclerotiorum faoi dhálaí cheaptha teasa (25 ± 2 °C, taiseachas coibhneasta 75 ± 1%, 8 uair an chloig solais/16 uair an chloig dorchadais). 7–10 lá tar éis cur (DPS), rinneadh na síológa a tanú chun dhá shíológ amháin a fhágáil le fás aonfhoirmeach agus trí dhuilleog lánfhairsingithe i ngach pota. Uiscíodh na plandaí potaithe go léir uair amháin gach coicís agus rinneadh leasú míosúil orthu ag an ráta molta don chineál áirithe.
Chun tiúchan 500 mg/L de L-ornithinediamine (ar a dtugtar aigéad (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic freisin; Sigma-Aldrich, Darmstadt, an Ghearmáin) a ullmhú, tuaslagadh 50 mg ar dtús i 100 mL d'uisce driogtha steiriúil. Caolaíodh an tuaslagán stoic ansin agus úsáideadh é i dturgnaimh ina dhiaidh sin. Go hachomair, tástáladh sé shraith de thiúchain L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, agus 125 mg/L) in vitro. Ina theannta sin, úsáideadh uisce driogtha steiriúil mar rialú diúltach (Mock) agus úsáideadh an fungaicíd tráchtála “Rizolex-T” púdar infhliuchtha 50% (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Governorate Gharbia, an Éigipt) mar rialú dearfach. Rinneadh tástáil in vitro ar an bhfungaicíd tráchtála “Rizolex-T” ag cúig thiúchan (2, 4, 6, 8 agus 10 mg/L).
Bailíodh samplaí de ghais agus de phoideanna pónairí coitianta a léirigh comharthaí tipiciúla múnla bán (ráta ionfhabhtaithe: 10–30%) ó fheirmeacha tráchtála. Cé gur aithníodh formhór na n-ábhar plandaí ionfhabhtaithe de réir speicis/chineáil (cineál tráchtála so-ghabhálach Giza 3), ba de speiceas anaithnid iad cinn eile, go háirithe iad siúd a fuarthas ó mhargaí áitiúla. Díghalraíodh dromchla na n-ábhar ionfhabhtaithe a bailíodh ar dtús le tuaslagán hipeaclóiríte sóidiam 0.5% ar feadh 3 nóiméad, ansin sruthlaíodh iad arís agus arís eile le huisce driogtha steiriúil agus triomaíodh iad le páipéar scagaire steiriúil chun an iomarca uisce a bhaint. Gearradh na horgáin ionfhabhtaithe ina bpíosaí beaga ón bhfíochán lár (idir fíocháin shláintiúla agus ionfhabhtaithe), saothraíodh iad ar mheán agair deaslós prátaí (PDA) agus goradh iad ag 25 ± 2 °C le timthriall solais 12 uair an chloig/dorchadas 12 uair an chloig ar feadh 5 lá chun foirmiú sclerotia a spreagadh. Baineadh úsáid as an modh barr mícéiliach freisin chun aonrúcháin fungasacha a íonú ó chultúir mheasctha nó éillithe. Aithníodh an t-aonrúchán fungasach íonaithe ar dtús bunaithe ar a shaintréithe moirfeolaíocha cultúrtha agus ansin deimhníodh gur S. sclerotiorum a bhí ann bunaithe ar ghnéithe micreascópacha. Ar deireadh, rinneadh tástáil ar na hiolraithe íonaithe go léir le haghaidh pataigineachta ar an gcultúr pónaire coitianta so-ghabhálach Giza 3 chun freastal ar phoist-ailt Koch.
Ina theannta sin, dearbhaíodh tuilleadh an t-aonrú S. sclerotiorum is ionraí (aonrú #3) bunaithe ar sheicheamhú spásaire trascríobhta inmheánach (ITS) mar a thuairiscigh White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Go hachomair, saothraíodh na haonrúcháin i mbrat deaslós prátaí (PDB) agus goradh iad ag 25 ± 2 °C ar feadh 5–7 lá. Bailíodh mícéiliam fungasach ansin, scagadh é trí éadach cáise, nite faoi dhó le huisce steiriúil, agus triomaíodh é le páipéar scagaire steiriúil. Aonraíodh DNA geanómach ag baint úsáide as an Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Ansin, rinneadh réigiún rDNA ITS a aimpliú ag baint úsáide as an bpéire tosaitheoirí sonrach ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; méid ionchais: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Cuireadh na táirgí PCR íonaithe isteach le haghaidh seicheamhaithe (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Rinneadh seicheamhú déthreoch ar sheichimh rDNA ITS ag baint úsáide as modh seicheamhaithe Sanger. Ansin, rinneadh comparáid idir na seichimh fiosrúcháin a cuireadh le chéile agus na sonraí is déanaí i GenBank agus san Ionad Náisiúnta um Fhaisnéis Biteicneolaíochta (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ag baint úsáide as bogearraí BLASTn. Rinneadh comparáid idir an seicheamh fiosrúcháin agus 20 stráins/aonrán eile de S. sclerotiorum a aisghabhadh ó na sonraí is déanaí i NCBI GenBank (Tábla Forlíontach S1) ag baint úsáide as ClustalW sa Phacáiste Anailíse Géineolaíochta Éabhlóideach Móilíneach (MEGA-11; leagan 11) (Kumar et al., 2024). Rinneadh anailís éabhlóideach ag baint úsáide as an modh dóchúlachta uasta agus an tsamhail ghinearálta in-athraithe ama um ionadú núicléatíde (Nei agus Kumar, 2000). Taispeántar an crann leis an dóchúlacht loga is airde. Roghnaítear an crann tosaigh don chuardach heorastach tríd an gcrann leis an dóchúlacht loga is airde a roghnú idir an crann comharsanachta (NJ) (Kumar et al., 2024) agus an crann parsimóineachta uasta (MP). Tógadh an crann NJ ag baint úsáide as maitrís achair phéireáilte arna ríomh ag baint úsáide as an tsamhail ghinearálta in-athraithe ama (Nei agus Kumar, 2000).
Cinneadh gníomhaíocht fhrithbhaictéarach L-ornithine agus an bhaictéiricíd “Rizolex-T” in vitro tríd an modh idirleata agair. Modh: Glac an méid cuí den tuaslagán stoic de L-ornithine (500 mg/L) agus measc go maith é le 10 ml den mheán cothaitheach PDA chun tuaslagáin a ullmhú le tiúchain deiridh de 12.5, 25, 50, 75, 100 agus 125 mg/L, faoi seach. Baineadh úsáid as cúig thiúchan den fhungaicíd “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 agus 10 mg/L) agus uisce driogtha steiriúil mar rialú. Tar éis don mheán soladú, aistríodh breiseán mícéiliach úr-ullmhaithe de chultúr Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm ar trastomhas, go lár an mhias Petri agus saothraíodh é ag 25±2°C go dtí gur chlúdaigh an mícéiliam an mhias rialaithe Petri ar fad, agus ina dhiaidh sin taifeadadh an fás fungasach. Ríomh an céatadán cosc ​​ar fhás gathach S. sclerotiorum ag baint úsáide as cothromóid 1:
Rinneadh an turgnamh faoi dhó, le sé mhacasamhlú bitheolaíoch do gach grúpa rialaithe/turgnamhach agus cúig phota (dhá phlanda in aghaidh an phota) do gach macasamhail bhitheolaíoch. Rinneadh anailís faoi dhó ar gach macasamhail bhitheolaíoch (dhá mhacasamhail theicniúla) chun cruinneas, iontaofacht agus atáirgtheacht na dtorthaí turgnamhacha a chinntiú. Ina theannta sin, úsáideadh anailís aischéimnithe probit chun an tiúchan coisctheach leath-uasta (IC50) agus IC99 a ríomh (Prentice, 1976).
Chun acmhainneacht L-ornithine faoi dhálaí cheaptha teasa a mheas, rinneadh dhá thurgnamh pota as a chéile. Go hachomair, líonadh potaí le hithir chré-gainimh steirilithe (3:1) agus cuireadh cultúr úr-ullmhaithe de S. sclerotiorum iontu. Ar dtús, saothraíodh an t-aonrú is ionraí de S. sclerotiorum (aonrú #3) trí sclerotium amháin a ghearradh ina dhá leath, é a chur aghaidh síos ar PDA agus é a ghoradh ag 25°C i ndorchadas tairiseach (24 uair an chloig) ar feadh 4 lá chun fás mícéiliach a spreagadh. Tógadh ceithre phlocóid agair 5 mm ar trastomhas ón imeall tosaigh ansin agus cuireadh 100 g de mheascán steiriúil de chruithneacht agus bran ríse (1:1, v/v) iontu agus goradh na fleascáin uile ag 25 ± 2 °C faoi thimthriall solais 12 uair an chloig/dorchadas 12 uair an chloig ar feadh 5 lá chun foirmiú sclerotia a spreagadh. Meascán maith a bhí sna fleascáin uile chun aonchineálacht a chinntiú sula gcuirfí ithir leis. Ansin, cuireadh 100 g den mheascán bran coilíniú le gach pota chun tiúchan tairiseach pataiginí a chinntiú. Uiscíodh na potaí ionaclaithe chun fás fungasach a ghníomhachtú agus cuireadh i ndálaí cheaptha teasa iad ar feadh 7 lá.
Cuireadh cúig shíol den chineál Giza 3 i ngach pota ansin. I gcás na bpotaí a ndearnadh cóireáil orthu le L-ornithine agus an fungaicíd Rizolex-T, sáithíodh na síolta steirilithe ar feadh dhá uair an chloig ar dtús i dtuaslagán uiscí den dá chomhdhúil le tiúchan deiridh IC99 de thart ar 250 mg/L agus 50 mg/L, faoi seach, agus ansin triomaíodh san aer iad ar feadh uair an chloig roimh an gcur. Ar an láimh eile, sáithíodh na síolta in uisce driogtha steiriúil mar rialú diúltach. Tar éis 10 lá, roimh an gcéad uisciú, tanaíodh na síológa, agus ní raibh ach dhá shíológ néata fágtha i ngach pota. Ina theannta sin, chun ionfhabhtú le S. sclerotiorum a chinntiú, gearradh gais phlandaí pónairí ag an gcéim forbartha chéanna (10 lá) ag dhá shuíomh éagsúla ag baint úsáide as scalpel steirilithe agus cuireadh thart ar 0.5 g den mheascán bran coilínithe i ngach créacht, agus ina dhiaidh sin cuireadh ard-taise orthu chun ionfhabhtú agus forbairt galair a spreagadh sna plandaí uile a ionaclaíodh. Rinneadh créachtú ar phlandaí rialaithe ar an gcaoi chéanna agus cuireadh méid comhionann (0.5 g) de mheascán bran steiriúil, neamhchoilínithe isteach sa chréacht agus coinníodh faoi ard-taise é chun an timpeallacht le haghaidh forbairt galair a insamhladh agus comhsheasmhacht a chinntiú idir na grúpaí cóireála.
Modh cóireála: Uiscíodh síológa pónairí le 500 ml de thuaslagán uiscí de L-ornithine (250 mg/l) nó an fungaicíd Rizolex-T (50 mg/l) tríd an ithir a uisciú, ansin rinneadh an chóireáil arís trí huaire ag eatramh 10 lá. Uiscíodh na rialuithe a ndearnadh cóireáil orthu le phlaicéabó le 500 ml d'uisce driogtha steiriúil. Rinneadh na cóireálacha go léir faoi choinníollacha cheaptha teasa (25 ± 2°C, 75 ± 1% taiseachas coibhneasta, agus fótathréimhse de 8 uair an chloig solais/16 uair an chloig dorchadais). Uiscíodh na potaí go léir gach coicís agus rinneadh iad a chóireáil go míosúil le leasachán NPK cothrom (20-20-20, le 3.6% sulfair agus micrea-eilimintí TE; Zain Seeds, an Éigipt) ag tiúchan 3–4 g/l trí spraeáil duilleach de réir na moltaí don chineál sonrach agus threoracha an mhonaróra. Mura ndeirtear a mhalairt, bailíodh duilleoga aibí lánleathnaithe (an 2ú agus an 3ú duilleog ón mbarr) ó gach macasamhail bhitheolaíoch 72 uair an chloig tar éis na cóireála (hpt), rinneadh iad a homaiginiú, a chomhthiomsú agus a stóráil ag -80 °C le haghaidh anailísí breise lena n-áirítear, ach gan a bheith teoranta dóibh, logánú histeiceimiceach in situ táscairí struis ocsaídiúcháin, peirocsaídiú lipid, frithocsaídeoirí einsímeacha agus neamh-einsímeacha agus léiriú géine.
Rinneadh measúnú seachtainiúil ar dhéine ionfhabhtaithe an mhúirín bháin 21 lá tar éis an ionfhabhtaithe (dpi) ag baint úsáide as scála 1–9 (Tábla Forlíontach S2) bunaithe ar scála Petzoldt agus Dickson (1996) arna mhodhnú ag Teran et al. (2006). Go hachomair, rinneadh scrúdú ar gais agus ar chraobhacha plandaí pónaire ag tosú ag pointe an ionfhabhtaithe chun dul chun cinn na ngortuithe a leanúint feadh na n-internóid agus na nóid. Ansin tomhaiseadh fad an ghortuithe ón bpointe ionfhabhtaithe go dtí an pointe is faide feadh an ghais nó na craoibhe agus sannadh scór 1–9 bunaithe ar shuíomh an ghortuithe, áit ar léirigh (1) nach raibh aon ionfhabhtú le feiceáil in aice leis an bpointe ionfhabhtaithe agus léirigh (2–9) méadú de réir a chéile ar mhéid agus ar dhul chun cinn an ghortuithe feadh na nóid/internóid (Tábla Forlíontach S2). Ansin tiontaíodh déine ionfhabhtaithe an mhúirín bháin go céatadán ag baint úsáide as foirmle 2:
Ina theannta sin, ríomhadh an limistéar faoi chuar dul chun cinn an ghalair (AUDPC) ag baint úsáide as an bhfoirmle (Shaner agus Finney, 1977), a oiriúnaíodh le déanaí do lobhadh bán pónaire coitianta (Chauhan et al., 2020) ag baint úsáide as cothromóid 3:
I gcás ina = Yi déine an ghalair ag am ti, Yi+1 = déine an ghalair ag an gcéad uair eile ti+1, ti = am an chéad tomhais (i laethanta), ti+1 = am an chéad tomhais eile (i laethanta), n = líon iomlán na bpointí ama nó na bpointí breathnóireachta. Taifeadadh paraiméadair fáis plandaí pónairí lena n-áirítear airde an phlanda (cm), líon na mbrainsí in aghaidh an phlanda, agus líon na nduilleog in aghaidh an phlanda gach seachtain ar feadh 21 lá i ngach macasamhla bitheolaíoch.
I ngach macasamhail bhitheolaíoch, bailíodh samplaí duille (an dara agus an tríú duilleog lánfhorbartha ón mbarr) ar lá 45 tar éis na cóireála (15 lá tar éis na cóireála deireanaí). Bhí cúig phota i ngach macasamhail bhitheolaíoch (dhá phlanda in aghaidh an phota). Baineadh úsáid as thart ar 500 mg den fhíochán brúite chun líocha fótaisintéiseacha (clóraifill a, clóraifill b agus carotenoidí) a bhaint amach ag baint úsáide as 80% aicéatón ag 4 °C sa dorchadas. Tar éis 24 uair an chloig, rinneadh na samplaí a lártheifneoiriú agus bailíodh an forshnáithín chun ábhar clóraifill a, clóraifill b agus carotenoidí a chinneadh go dathmhéadrach ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV-160A (Shimadzu Corporation, an tSeapáin) de réir mhodh (Lichtenthaler, 1987) tríd an ionsú a thomhas ag trí thonnfhad éagsúla (A470, A646 agus A663 nm). Ar deireadh, ríomhadh ábhar na líocha fótaisintéiseacha ag baint úsáide as na foirmlí seo a leanas 4–6 a thuairiscigh Lichtenthaler (1987).
72 uair an chloig tar éis na cóireála (hpt), bailíodh duilleoga (an dara agus an tríú duilleog lánfhorbartha ón mbarr) ó gach macasamhail bhitheolaíoch le haghaidh logánú histeiceimiceach in situ sárocsaíd hidrigine (H2O2) agus anian sárocsaíde (O2•−). Bhí cúig phota i ngach macasamhail bhitheolaíoch (dhá phlanda in aghaidh an phota). Rinneadh anailís dhúblach ar gach macasamhail bhitheolaíoch (dhá mhacasamhail theicniúla) chun cruinneas, iontaofacht agus atáirgtheacht an mhodha a chinntiú. Cinneadh H2O2 agus O2•− ag baint úsáide as 0.1% 3,3′-dé-aimínbeinsidín (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, an Ghearmáin) nó níotrághorm teitreasóiliam (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, an Ghearmáin), faoi seach, ag leanúint na modhanna a thuairiscigh Romero-Puertas et al. (2004) agus Adam et al. (1989) le mionathruithe. Chun H2O2 a shuíomh go histeiceimiceach in situ, rinneadh na bileoga a ionfhabhtú faoi fholús le 0.1% DAB i maolán Tris 10 mM (pH 7.8) agus ansin goradh iad ag teocht an tseomra sa solas ar feadh 60 nóiméad. Rinneadh na bileoga a thuaradh i 0.15% (v/v) TCA in eatánól:clóraform 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caireo, an Éigipt) agus ansin nochtadh don solas iad go dtí gur dhorchaigh siad. Ar an gcaoi chéanna, rinneadh na comhlaí a ionfhabhtú faoi fholús le maolán fosfáite potaisiam 10 mM (pH 7.8) ina raibh 0.1 w/v % HBT chun O2•− a shuíomh go histeiceimiceach in situ. Goradh na bileoga sa solas ag teocht an tseomra ar feadh 20 nóiméad, ansin tuaradh iad mar atá thuas, agus ansin soilsiú iad go dtí gur tháinig spotaí gorma/corcra dorcha chun cinn. Rinneadh measúnú ar dhéine an datha donn (mar tháscaire H2O2) nó gorm-corcra (mar tháscaire O2•−) a eascraíonn as sin ag baint úsáide as leagan Fidsí den phacáiste próiseála íomhá ImageJ (http://fiji.sc; rochtain déanta air an 7 Márta 2024).
Cinneadh malondialdehyde (MDA; mar mharcóir ar pheirocsaídiú lipid) de réir mhodh Du agus Bramlage (1992) le mionathruithe. Bailíodh duilleoga ó gach macasamhail bhitheolaíoch (an dara agus an tríú duilleog lánfhorbartha ón mbarr) 72 uair an chloig tar éis na cóireála (hpt). Bhí cúig phota (dhá phlanda in aghaidh an phota) i ngach macasamhail bhitheolaíoch. Rinneadh anailís dhúblach ar gach macasamhail bhitheolaíoch (dhá mhacasamhail theicniúla) chun cruinneas, iontaofacht agus atáirgtheacht an mhodha a chinntiú. Go hachomair, úsáideadh 0.5 g d'fhíochán duille meilte le haghaidh eastóscadh MDA le 20% aigéad tríchlóraicéiteach (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, SAM) ina raibh 0.01% hiodrocsaitoluéin búitileáilte (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM). Ansin, cinneadh cion MDA san fhorshnáithín go dathmhéadrach tríd an ionsú a thomhas ag 532 agus 600 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV-160A (Shimadzu Corporation, an tSeapáin) agus ansin léiríodh é mar nmol g−1 FW.
Chun measúnú a dhéanamh ar fhrithocsaídeoirí einsímeacha agus neamh-einsímeacha, bailíodh duilleoga (an dara agus an tríú duilleog lánfhorbartha ón mbarr) ó gach macasamhail bhitheolaíoch 72 uair an chloig tar éis na cóireála (hpt). Bhí cúig phota i ngach macasamhail bhitheolaíoch (dhá phlanda in aghaidh an phota). Rinneadh anailís dhúblach ar gach sampla bitheolaíoch (dhá shampla teicniúil). Meilteadh dhá dhuilleog le nítrigin leachtach agus úsáideadh iad go díreach chun frithocsaídeoirí einsímeacha agus neamh-einsímeacha, aimínaigéid iomlána, cion próilín, léiriú géine, agus cainníochtú ocsalate a chinneadh.
Cinneadh feinil intuaslagtha iomlána ag baint úsáide as imoibrí Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) le mionathruithe ar an modh a thuairiscigh Kahkonen et al. (1999). Go hachomair, baineadh thart ar 0.1 g de fhíochán duille homaiginithe le 20 ml meatánól 80% sa dorchadas ar feadh 24 uair an chloig agus bailíodh an forshnáithín tar éis lártheifneoirithe. Meascadh 0.1 ml den sliocht samplach le 0.5 ml imoibrí Folin-Ciocalteu (10%), croitheadh ​​ar feadh 30 soicind agus fágadh sa dorchadas é ar feadh 5 nóiméad. Ansin cuireadh 0.5 ml de thuaslagán carbónáite sóidiam 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Caireo, an Éigipt) le gach feadán, meascadh go maith é agus goradh é ag teocht an tseomra sa dorchadas ar feadh 1 uair an chloig. Tar éis goradh, tomhaiseadh ionsú an mheascáin imoibrithe ag 765 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV-160A (Shimadzu Corporation, an tSeapáin). Cinneadh tiúchan na bhfeanól intuaslagtha iomlán sna sleachta samplacha ag baint úsáide as cuar calabrúcháin aigéid ghailí (Fisher Scientific, Hampton, NH, SAM) agus léiríodh é mar milleagraim de choibhéis aigéid ghailí in aghaidh an ghraim de mheáchan úr (mg GAE g-1 meáchan úr).
Cinneadh cion iomlán flavonoid intuaslagtha de réir mhodh Djeridane et al. (2006) le mionathruithe. Go hachomair, meascadh 0.3 ml den sliocht meatánóil thuas le 0.3 ml de thuaslagán clóiríd alúmanaim 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, SAM), corraíodh go bríomhar é agus ansin goradh é ag teocht an tseomra ar feadh 5 nóiméad, agus ina dhiaidh sin cuireadh 0.3 ml de thuaslagán aicéatáit photaisiam 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caireo, an Éigipt) leis, meascadh go maith é agus goradh é ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad sa dorchadas. Tar éis goradh, tomhaiseadh ionsú an mheascáin imoibrithe ag 430 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV-160A (Shimadzu Corporation, an tSeapáin). Cinneadh tiúchan na flavonoid intuaslagtha iomlán sna sleachta samplacha ag baint úsáide as cuar calabrúcháin rutin (TCI America, Portland, OR, SAM) agus ansin léiríodh é mar mhilleagram de choibhéis rutin in aghaidh an ghraim de mheáchan úr (mg RE g-1 meáchan úr).
Cinneadh cion iomlán aimínaigéid shaora duilleoga pónairí ag baint úsáide as imoibrí ninhydrin modhnaithe (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAM) bunaithe ar an modh a mhol Yokoyama agus Hiramatsu (2003) agus a mhodhnaigh Sun et al. (2006). Go hachomair, baineadh 0.1 g d'fhíochán meilte le maolán pH 5.4, agus imoibrigh 200 μL den fhorshnáithín le 200 μL de ninhydrin (2%) agus 200 μL de phiodrídín (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, SAM), goradh i ndabhach uisce fiuchta ar feadh 30 nóiméad, ansin fuaraíodh agus tomhaiseadh é ag 580 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV-160A (Shimadzu Corporation, an tSeapáin). Ar an láimh eile, cinneadh próilín trí mhodh Bates (Bates et al., 1973). Baineadh próilín le 3% aigéad sulfosalicylic (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAM) agus tar éis lártheifneoirithe, meascadh 0.5 ml den fhorshnáithín le 1 ml d'aigéad aicéiteach oighreach (Fisher Scientific, Hampton, NH, SAM) agus imoibrí ninhydrin, goradh é ag 90°C ar feadh 45 nóiméad, fuaraíodh é agus tomhaiseadh é ag 520 nm ag baint úsáide as an speictreafótaiméadar céanna agus atá thuas. Cinneadh iomlán na n-aimínaigéid shaora agus próilín sna sleachta duille ag baint úsáide as cuar calabrúcháin glicín agus próilín (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SAM), faoi seach, agus léiríodh iad mar mg/g de mheáchan úr.
Chun gníomhaíocht einsímeach einsímí frithocsaídeacha a chinneadh, rinneadh thart ar 500 mg d'fhíochán homaiginithe a bhaint le 3 ml de mhaolán Tris 50 mM (pH 7.8) ina raibh 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) agus 7.5% polaivinilpirrolidón (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM), a lártheifneoiriú ag 10,000 × g ar feadh 20 nóiméad faoi chuisniú (4 °C), agus bailíodh an forshnáithín (sliocht einsíme amh) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ansin, imoibrigh cataláis (CAT) le 2 ml de mhaolán fosfáite sóidiam 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAM) agus 100 μl de thuaslagán 269 mM H2O2 chun a ghníomhaíocht einsímeach a chinneadh de réir mhodh Aebi (1984) le mionathruithe (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Cinneadh gníomhaíocht einsímeach peirocsaídáise atá ag brath ar Guaiacol (POX) ag baint úsáide as modh Harrach et al. (2009). (2008) le mionathruithe (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) agus cinneadh gníomhaíocht einsímeach polaifeanól ocsaídáise (PPO) tar éis imoibriú le 2.2 ml de mhaolán fosfáite sóidiam 100 mM (pH 6.0), 100 μl de guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, SAM) agus 100 μl de 12 mM H2O2. Rinneadh beagán modhnaithe ar an modh ó (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Rinneadh an anailís tar éis imoibriú le 3 ml de thuaslagán catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAM) (0.01 M) úr-ullmhaithe i maolán fosfáite 0.1 M (pH 6.0). Tomhaiseadh gníomhaíocht CAT trí mhonatóireacht a dhéanamh ar dhianscaoileadh H2O2 ag 240 nm (A240), tomhaiseadh gníomhaíocht POX trí mhonatóireacht a dhéanamh ar an méadú ar ionsú ag 436 nm (A436), agus tomhaiseadh gníomhaíocht PPO trí luaineachtaí ionsú a thaifeadadh ag 495 nm (A495) gach 30 soicind ar feadh 3 nóiméad ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV-160A (Shimadzu, an tSeapáin).
Baineadh úsáid as RT-PCR fíor-ama chun leibhéil trascríbhinne trí ghéin a bhaineann le frithocsaídeoirí a bhrath, lena n-áirítear cataláis pheirocsaisómach (PvCAT1; Uimhir Aontachais GenBank KF033307.1), dismutase sárocsaíde (PvSOD; Uimhir Aontachais GenBank XM_068639556.1), agus laghdaitheoir glútaitióin (PvGR; Uimhir Aontachais GenBank KY195009.1), i nduilleoga pónairí (an dara agus an tríú duilleog lánfhorbartha ón mbarr) 72 uair an chloig tar éis na cóireála deireanaí. Go hachomair, rinneadh RNA a leithlisiú ag baint úsáide as an Simply P Total RNA Extraction Kit (Uimhir Chatalóige BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, an tSín) de réir phrótacal an mhonaróra. Ansin, sintéisíodh cDNA ag baint úsáide as an TOP script™ cDNA Synthesis Kit de réir threoracha an mhonaróra. Tá seichimh tosaitheoirí na dtrí ghéin thuas liostaithe i dTábla Forlíontach S3. Baineadh úsáid as PvActin-3 (uimhir iontrála GenBank: XM_068616709.1) mar an ghéin tí agus ríomhadh an léiriú géine coibhneasta ag baint úsáide as an modh 2-ΔΔCT (Livak agus Schmittgen, 2001). Léiríodh cobhsaíocht aictin faoi strus bitheach (idirghníomhaíocht neamh-chomhoiriúnach idir pischineálaigh choitianta agus an fungas antraicnóis Colletotrichum lindemuthianum) agus strus abhíteach (triomach, salandacht, teocht íseal) (Borges et al., 2012).
Ar dtús, rinneamar anailís in silico ar fud an ghéanóim ar phróitéiní oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) i S. sclerotiorum ag baint úsáide as an uirlis próitéin-phróitéine BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Go hachomair, d'úsáideamar OAH ó Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; tacsíd: 1191702; uimhir iontrála GenBank XP_040799428.1; 342 aimínaigéad) agus Penicillium lagena (PlOAH; tacsíd: 94218; uimhir iontrála GenBank XP_056833920.1; 316 aimínaigéad) mar sheichimh cheiste chun an próitéin homalógach i S. sclerotiorum (tacsíd: 5180) a mhapáil. Rinneadh BLASTp i gcoinne na sonraí géanóim S. sclerotiorum is déanaí atá ar fáil i GenBank ar shuíomh gréasáin an Ionaid Náisiúnta um Fhaisnéis Biteicneolaíochta (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ina theannta sin, rinneadh an géin OAH tuartha ó S. sclerotiorum (SsOAH) agus an anailís éabhlóideach agus crann fíliginéiteach AfOAH ó A. fijiensis CBS 313.89 agus PlOAH ó P. lagena a asbhaint ag baint úsáide as an modh dóchúlachta uasta i MEGA11 (Tamura et al., 2021) agus an tsamhail bunaithe ar mhaitrís JTT (Jones et al., 1992). Comhcheanglaíodh an crann fíliginéiteach leis an anailís ailínithe il ar sheichimh próitéine na ngéinte OAH tuartha go léir (SsOAH) ó S. sclerotiorum agus an seicheamh fiosrúcháin ag baint úsáide as an Uirlis Ailínithe Bunaithe ar Shrianta (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos agus Agarwala, 2007). Ina theannta sin, rinneadh na seichimh aimínaigéid is fearr a mheaitseálann SsOAH ó S. sclerotiorum a ailíniú leis na seichimh cheiste (AfOAH agus PlOAH) (Larkin et al., 2007) ag baint úsáide as ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), agus rinneadh réigiúin chaomhnaithe san ailíniú a léirshamhlú ag baint úsáide as an uirlis ESPript (leagan 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Ina theannta sin, rinneadh na fearainn ionadaíocha feidhmiúla tuartha agus na suíomhanna caomhnaithe de S. sclerotiorum SsOAH a aicmiú go hidirghníomhach i dteaghlaigh éagsúla ag baint úsáide as an uirlis InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Ar deireadh, rinneadh samhaltú struchtúir tríthoiseach (3T) den S. sclerotiorum SsOAH tuartha ag baint úsáide as an Inneall Aitheantais Próitéine Homalaíochta/Analaí (freastalaí Phyre2 leagan 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) agus bailíochtú ag baint úsáide as an bhfreastalaí SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Rinneadh na struchtúir thríthoiseacha tuartha (formáid PDB) a léirshamhlú go hidirghníomhach ag baint úsáide as an bpacáiste UCSF-Chimera (leagan 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Baineadh úsáid as PCR cainníochtúil fíor-ama fluaraiseachta chun leibhéal trascríobhach oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; uimhir iontrála GenBank: XM_001590428.1) a chinneadh i mícéilia Sclerotinia sclerotiorum. Go hachomair, rinneadh S. sclerotiorum a ionaclú i bhfleascán ina raibh PDB agus cuireadh i ngoradán croitheadh ​​é (samhail: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SAM) ag 25 ± 2 °C ar feadh 24 uair an chloig ag 150 rpm agus i ndorchadas tairiseach (24 uair an chloig) chun fás mícéiliach a spreagadh. Ina dhiaidh sin, rinneadh na cealla a chóireáil le L-ornithine agus an fungaicíd Rizolex-T ag tiúchain deiridh IC50 (thart ar 40 agus 3.2 mg/L, faoi seach) agus ansin saothraíodh iad ar feadh 24 uair an chloig eile faoi na coinníollacha céanna. Tar éis an ghoir, rinneadh na cultúir a lártheifneoiriú ag 2500 rpm ar feadh 5 nóiméad agus bailíodh an forshnáithín (micéiliam fungasach) le haghaidh anailíse ar léiriú géine. Ar an gcaoi chéanna, bailíodh mícéiliam fungasach ag 0, 24, 48, 72, 96, agus 120 uair an chloig tar éis an ionfhabhtaithe ó phlandaí ionfhabhtaithe a raibh múnla bán agus mícéiliam cadáis déanta acu ar dhromchla na bhfíochán ionfhabhtaithe. Baineadh RNA as an mícéiliam fungasach agus ansin sintéisíodh cDNA mar a thuairiscítear thuas. Tá na seichimh tosaithe le haghaidh SsOAH liostaithe i dTábla Forlíontach S3. Baineadh úsáid as SsActin (uimhir iontrála GenBank: XM_001589919.1) mar an ghéin tí, agus ríomhadh léiriú géine coibhneasta ag baint úsáide as an modh 2-ΔΔCT (Livak agus Schmittgen, 2001).
Cinneadh aigéad ocsaileach i mbrat deasglúcós prátaí (PDB) agus i samplaí plandaí ina raibh an pataigin fungasach Sclerotinia sclerotiorum de réir mhodh Xu agus Zhang (2000) le mionathruithe. Go hachomair, rinneadh iargúltaí S. sclerotiorum a ionaclú i bhfleascáin ina raibh PDB agus ansin rinneadh iad a shaothrú i ngoradán croitheadh ​​(samhail I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SAM) ag 150 rpm ag 25 ± 2 °C ar feadh 3–5 lá i ndorchadas tairiseach (24 uair an chloig) chun fás mícéiliach a spreagadh. Tar éis an ghoir, scagadh an cultúr fungasach ar dtús trí pháipéar scagaire Whatman #1 agus ansin rinneadh lártheifneoiriú air ag 2500 rpm ar feadh 5 nóiméad chun an mícéiliam iarmharach a bhaint. Bailíodh an forshnáithín agus stóráladh é ag 4°C chun tuilleadh cinntithe cainníochtúla ar ocsaláit a dhéanamh. Chun samplaí plandaí a ullmhú, baineadh thart ar 0.1 g de bhlúirí fíocháin plandaí trí huaire le huisce driogtha (2 ml gach uair). Ansin rinneadh na samplaí a lártheifneoiriú ag 2500 rpm ar feadh 5 nóiméad, scagadh an forshnáithín go tirim trí pháipéar scagaire Whatman Uimh. 1 agus bailíodh é le haghaidh tuilleadh anailíse.
Chun anailís chainníochtúil a dhéanamh ar aigéad ocsaileach, ullmhaíodh an meascán imoibrithe i bhfeadán gloine le stopallán san ord seo a leanas: 0.2 ml den sampla (nó scagáit chultúir PDB nó tuaslagán caighdeánach aigéad ocsaileach), 0.11 ml de ghorm brómaifeanóil (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, SAM), 0.198 ml d'aigéad sulfarach 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caireo, an Éigipt) agus 0.176 ml de dhéchrómáit photaisiam 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, SAM), agus ansin caolaíodh an tuaslagán go 4.8 ml le huisce driogtha, meascadh go bríomhar é agus cuireadh láithreach i ndabhach uisce 60 °C é. Tar éis 10 nóiméad, stopadh an t-imoibriú trí 0.5 ml de thuaslagán hiodrocsaíde sóidiam (NaOH; 0.75 M) a chur leis. Tomhaiseadh ionsú (A600) an mheascáin imoibrithe ag 600 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar UV-160 (Shimadzu Corporation, an tSeapáin). Baineadh úsáid as PDB agus uisce driogtha mar rialuithe chun scagáití cultúir agus samplaí plandaí a chainníochtú, faoi seach. Cinneadh tiúchan aigéid ocsailaigh sna scagáití cultúir, arna shloinneadh mar mhicreagraim d'aigéad ocsaileach in aghaidh an mhillilítear de mheán PDB (μg.mL−1), agus sna sleachta duille, arna shloinneadh mar mhicreagraim d'aigéad ocsaileach in aghaidh an ghraim de mheáchan úr (μg.g−1 FW), ag baint úsáide as cuar calabrúcháin aigéid ocsailaigh (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, SAM).
Le linn an staidéir, dearadh na turgnaimh uile i ndearadh randamach go hiomlán (CRD) le sé mhacasamhlú bitheolaíoch in aghaidh na cóireála agus cúig phota in aghaidh an mhacasamhail bhitheolaíoch (dhá phlanda in aghaidh an phota) mura ndeirtear a mhalairt. Rinneadh anailís dhúblach ar mhacasamhla bitheolaíocha (dhá mhacasamhlú teicniúil). Baineadh úsáid as macasamhla teicniúla chun in-atáirgtheacht an turgnaimh chéanna a sheiceáil ach níor úsáideadh iad san anailís staitistiúil chun macasamhla bréagacha a sheachaint. Rinneadh anailís staitistiúil ar na sonraí ag baint úsáide as anailís athraitheachta (ANOVA) agus ina dhiaidh sin tástáil difríochta suntasaí macánta Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). I gcás turgnaimh in vitro, ríomhadh luachanna IC50 agus IC99 ag baint úsáide as an tsamhail probit agus ríomhadh eatraimh mhuiníne 95%.
Bailíodh ceithre iargúltán san iomlán ó pháirceanna pónairí soighe éagsúla i nGobharnóireacht El Ghabiya, san Éigipt. Ar mheán PDA, tháirg na hiargúltáin uile mícéiliam bán uachtarúil a d’iompaigh bán cadáiseach go tapa (Fíor 1A) agus ansin beige nó donn ag céim an sclerotium. De ghnáth bíonn sclerotia dlúth, dubh, sféarúil nó neamhrialta i gcruth, 5.2 go 7.7 mm ar fhad agus 3.4 go 5.3 mm ar trastomhas (Fíor 1B). Cé gur fhorbair ceithre iargúltán patrún imeallach sclerotia ag imeall an mheáin chultúir tar éis 10–12 lá goradáin ag 25 ± 2 °C (Fíor 1A), bhí difríocht shuntasach eatarthu i líon na sclerotia in aghaidh an phláta (P < 0.001), agus an líon is airde sclerotia ag iargúltán 3 (32.33 ± 1.53 sclerotia in aghaidh an phláta; Fíor 1C). Ar an gcaoi chéanna, tháirg aonrú #3 níos mó aigéid ocsaileach i PDB ná aonrúcháin eile (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fíor 1D). Léirigh aonrú #3 tréithe moirfeolaíocha agus micreascópacha tipiciúla an fhungais fíteapatagineach Sclerotinia sclerotiorum. Mar shampla, ar PDA, d'fhás coilíneachtaí aonrú #3 go tapa, bhí siad bán uachtarúil (Fíor 1A), beige droim ar ais nó buí-donn éadrom bradán, agus bhí 6-7 lá ag teastáil uathu ag 25 ± 2°C chun dromchla pláta 9 cm ar trastomhas a chlúdach go hiomlán. Bunaithe ar na tréithe moirfeolaíocha agus micreascópacha thuas, aithníodh aonrú #3 mar Sclerotinia sclerotiorum.
Fíor 1. Saintréithe agus pataigineacht iargúltaí S. sclerotiorum ó bharra coitianta léagúim. (A) Fás mícéiliach ceithre iargúltaí S. sclerotiorum ar mheán PDA, (B) scleróitia ceithre iargúltaí S. sclerotiorum, (C) líon na scleróitia (in aghaidh an phláta), (D) secretion aigéad ocsaileach ar mheán PDB (μg.mL−1), agus (E) déine galair (%) ceithre iargúltaí S. sclerotiorum ar chultúr léagúim tráchtála so-ghabhálach Giza 3 faoi dhálaí cheaptha teasa. Léiríonn luachanna an meán ± SD de chúig mhacasamhlú bitheolaíoch (n = 5). Léiríonn litreacha difriúla difríochtaí suntasacha staitistiúla idir cóireálacha (p < 0.05). (F–H) Bhí comharthaí tipiciúla múnla bán le feiceáil ar gais agus ar shiliques os cionn na talún, faoi seach, 10 lá tar éis ionaclú le hiargúltaí #3 (dpi). (I) Rinneadh anailís éabhlóideach ar réigiún an spásaire tras-scríofa inmheánach (ITS) d'aonrú S. sclerotiorum #3 ag baint úsáide as an modh uas-dóchúlachta agus rinneadh comparáid idir é agus 20 aonrú/stráin tagartha a fuarthas ó bhunachar sonraí an Ionaid Náisiúnta um Fhaisnéis Biteicneolaíochta (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Léiríonn na huimhreacha os cionn na línte braislithe clúdach an réigiúin (%), agus léiríonn na huimhreacha faoi bhun na línte braislithe fad na brainse.
Ina theannta sin, chun an pataigineacht a dhearbhú, úsáideadh ceithre iargúltán S. sclerotiorum a fuarthas chun an cultivar pónaire tráchtála so-ghabhálach Giza 3 a ionfhabhtú faoi dhálaí cheaptha teasa, rud atá comhsheasmhach le postulates Koch (Fíor 1E). Cé gur pataigineach a bhí na hiargúltáin fungasacha go léir a fuarthas agus go bhféadfaidís an pónaire glas (cv. Giza 3) a ionfhabhtú, rud a d’fhág go raibh comharthaí tipiciúla múnla bán ar gach cuid os cionn na talún (Fíor 1F), go háirithe ar na gais (Fíor 1G) agus na pods (Fíor 1H) 10 lá tar éis an ionfhabhtaithe (dpi), ba é iargúltán 3 an t-iargúltán ba ionsaithí i ndá thurgnamh neamhspleácha. Bhí an déine galair is airde (%) ag Iargúltán 3 ar phlandaí pónaire (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, agus 76.7 ± 3.1 ag 7, 14, agus 21 lá tar éis an ionfhabhtaithe, faoi seach; Fíor 1F).
Deimhníodh tuilleadh sainaithint an iargúlta S. sclerotiorum #3 is ionraí bunaithe ar sheicheamhú spásaire tras-scríofa inmheánach (ITS) (Fíor 1I). Léirigh anailís fíligéiniteach idir iargúlta #3 agus 20 iargúlta/stráin tagartha cosúlacht ard (>99%) eatarthu. Is fiú a thabhairt faoi deara go bhfuil cosúlacht ard ag iargúlta S. sclerotiorum #3 (533 bp) leis an iargúlta S. sclerotiorum Meiriceánach LPM36 a iargúltaíodh ó shíolta piseanna tirime (uimhir iontrála GenBank MK896659.1; 540 bp) agus an iargúlta S. sclerotiorum Síneach YKY211 (uimhir iontrála GenBank OR206374.1; 548 bp), rud a fhágann lobhadh gais corcra (Matthiola incana), agus tá siad uile grúpáilte ar leithligh ag barr an deindreagraim (Fíor 1I). Tá an seicheamh nua taiscthe i mbunachar sonraí NCBI agus tugadh “Sclerotinia sclerotiorum – leithlis YN-25” air (uimhir iontrála GenBank PV202792). Is léir gurb é leithlis 3 an leithlis is ionraí; dá bhrí sin, roghnaíodh an leithlis seo le haghaidh staidéir i ngach turgnamh ina dhiaidh sin.
Rinneadh imscrúdú in vitro ar ghníomhaíocht fhrithbhaictéarach an dé-aimín L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, an Ghearmáin) ag tiúchain éagsúla (12.5, 25, 50, 75, 100 agus 125 mg/L) i gcoinne S. sclerotiorum leithlisithe 3. Is suntasach an rud é gur chuir L-ornithine éifeacht fhrithbhaictéarach i bhfeidhm agus gur chuir sé cosc ​​de réir a chéile ar fhás gathach hífí S. sclerotiorum ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 2A, B). Ag an tiúchan is airde a tástáladh (125 mg/L), léirigh L-ornithine an ráta cosc ​​fáis mícéiliach is airde (99.62 ± 0.27%; Fíor 2B), rud a bhí coibhéiseach leis an bhfungaicíd tráchtála Rizolex-T (ráta cosc ​​99.45 ± 0.39%; Fíor 2C) ag an tiúchan is airde a tástáladh (10 mg/L), rud a léiríonn éifeachtúlacht chomhchosúil.
Fíor 2. Gníomhaíocht fhrithbhaictéarach in vitro L-ornithine i gcoinne Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparáid idir gníomhaíocht fhrithbhaictéarach tiúchain éagsúla L-ornithine i gcoinne S. sclerotiorum leis an bhfungaicíd tráchtála Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Ráta coisctheach (%) ar fhás mícéiliach S. sclerotiorum tar éis cóireála le tiúchain éagsúla L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 agus 125 mg/L) nó Rizolex-T (2, 4, 6, 8 agus 10 mg/L), faoi seach. Léiríonn na luachanna an meán ± SD de chúig mhacasamhlú bitheolaíoch (n = 5). Léiríonn litreacha difriúla difríochtaí staitistiúla idir cóireálacha (p < 0.05). (D, E) Anailís aischéimniúcháin samhail Probit ar L-ornithine agus ar an bhfungaicíd tráchtála Rizolex-T, faoi seach. Taispeántar líne aischéimniúcháin an mhúnla probit mar líne ghorm sholadach, agus taispeántar an t-eatramh muiníne (95%) mar líne dhearg stróicthe.
Ina theannta sin, rinneadh anailís aischéimniúcháin probit agus taispeántar na plotaí comhfhreagracha i dTábla 1 agus i bhFíor 2D,E. Go hachomair, léirigh an luach fána inghlactha (y = 2.92x − 4.67) agus staitisticí suntasacha gaolmhara (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 agus p < 0.0001; Fíor 2D) de L-ornithine gníomhaíocht fhrithfhungach fheabhsaithe i gcoinne S. sclerotiorum i gcomparáid leis an bhfungaicíd tráchtála Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 agus p < 0.0001) (Tábla 1).
Tábla 1. Luachanna tiúchana coisctheach leath-uasta (IC50) agus IC99 (mg/l) de L-ornithine agus an fhungaicíd tráchtála “Rizolex-T” i gcoinne S. sclerotiorum.
Tríd is tríd, laghdaigh L-ornithine (250 mg/L) forbairt agus déine an mhúnla bhán go suntasach ar phlandaí pónaire coitianta cóireáilte i gcomparáid le plandaí neamhchóireáilte atá ionfhabhtaithe le S. sclerotiorum (rialú; Fíor 3A). Go hachomair, cé gur mhéadaigh déine an ghalair i bplandaí rialaithe ionfhabhtaithe neamhchóireáilte de réir a chéile (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, agus 92.33 ± 3.06%), laghdaigh L-ornithine déine an ghalair (%) go suntasach i rith an turgnaimh (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, agus 26.36 ± 3.07) ag 7, 14, agus 21 lá tar éis na cóireála (dpt), faoi seach (Fíor 3A). Ar an gcaoi chéanna, nuair a rinneadh plandaí pónairí atá ionfhabhtaithe le S. sclerotiorum a chóireáil le 250 mg/L de L-ornithine, laghdaigh an limistéar faoi chuar dul chun cinn an ghalair (AUDPC) ó 1274.33 ± 33.13 sa rialú neamhchóireáilte go 281.03 ± 7.95, a bhí beagán níos ísle ná an limistéar sa rialú dearfach fungaicíd Rizolex-T 50 mg/L (183.61 ± 7.71; Fíor 3B). Breathnaíodh an treocht chéanna sa dara turgnamh.
Fíor 3. Éifeacht chur i bhfeidhm eisgéineach L-ornithine ar fhorbairt lobhadh bán pónaire coitinn de bharr Sclerotinia sclerotiorum faoi dhálaí cheaptha teasa. (A) Cuar dul chun cinn galair múnla bán pónaire coitinn tar éis cóireála le 250 mg/L L-ornithine. (B) Achar faoin gcuar dul chun cinn galair (AUDPC) múnla bán pónaire coitinn tar éis cóireála le L-ornithine. Léiríonn luachanna an meán ± SD de chúig mhacasamhlú bitheolaíoch (n = 5). Léiríonn litreacha difriúla difríochtaí suntasacha staitistiúla idir cóireálacha (p < 0.05).
Mhéadaigh cur i bhfeidhm eisgéineach 250 mg/L L-ornithine airde an phlanda de réir a chéile (Fíor 4A), líon na mbrainsí in aghaidh an phlanda (Fíor 4B), agus líon na nduilleog in aghaidh an phlanda (Fíor 4C) tar éis 42 lá. Cé gur bhain an éifeacht is mó leis an bhfungaicíd tráchtála Rizolex-T (50 mg/L) ar na paraiméadair chothaitheacha go léir a ndearnadh staidéar orthu, ba é cur i bhfeidhm eisgéineach 250 mg/L L-ornithine an dara héifeacht is mó i gcomparáid le rialuithe neamhchóireáilte (Fíor 4A–C). Ar an láimh eile, ní raibh aon éifeacht shuntasach ag cóireáil L-ornithine ar ábhar na líocha fótaisintéiseacha clóraifill a (Fíor 4D) agus clóraifill b (Fíor 4E), ach mhéadaigh sé beagán an t-ábhar caratinoid iomlán (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) i gcomparáid leis an rialú diúltach (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) agus an rialú dearfach (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fíor 4F). Tríd is tríd, léiríonn na torthaí seo nach bhfuil L-ornithine fíteatocsaineach do phlandaí cóireáilte agus go bhféadfadh sé fiú a bhfás a spreagadh.
Fíor 4. Éifeacht chur i bhfeidhm eisgéineach L-ornithine ar shaintréithe fáis agus líocha fótaisintéiseacha duilleoga pónairí atá ionfhabhtaithe le Sclerotinia sclerotiorum faoi dhálaí cheaptha teasa. (A) Airde an phlanda (cm), (B) Líon na mbrainsí in aghaidh an phlanda, (C) Líon na nduilleog in aghaidh an phlanda, (D) Ábhar clóraifill a (mg g-1 fr wt), (E) Ábhar clóraifill b (mg g-1 fr wt), (F) Ábhar iomlán caratinoid (mg g-1 fr wt). Is iad na luachanna an meán ± SD de chúig mhacasamhlú bitheolaíoch (n = 5). Léiríonn litreacha difriúla difríochtaí suntasacha ó thaobh staitisticí de idir cóireálacha (p < 0.05).
Léirigh logánú histeiceimiceach in situ speiceas ocsaigine imoibríoch (ROS; léirithe mar shárocsaíd hidrigine [H2O2]) agus fréamhacha saora (léirithe mar aniain shárocsaíde [O2•−]) gur laghdaigh cur i bhfeidhm eisgéineach L-ornithine (250 mg/L) carnadh H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fíor 5A) agus O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fíor 5B) go suntasach i gcomparáid le carnadh plandaí ionfhabhtaithe neamhchóireáilte (173.31 ± 12.06 agus 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, faoi seach) agus plandaí a ndearnadh cóireáil orthu le 50 mg/L den fhungaicíd tráchtála Rizolex-T (170.12 ± 9.50 agus 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, faoi seach) ag 72 uair an chloig. Carnadh leibhéil arda H2O2 agus O2•− faoi hpt (Fíor 5A, B). Ar an gcaoi chéanna, léirigh anailís malondialdehyde (MDA) bunaithe ar TCA go raibh leibhéil níos airde de MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) carntha i bplandaí pónairí ionfhabhtaithe le S. sclerotiorum ina nduilleoga (Fíor 5C). Mar sin féin, laghdaigh cur i bhfeidhm eisgéineach L-ornithine peirocsaídiú lipid go suntasach mar is léir ón laghdú ar ábhar MDA i bplandaí cóireáilte (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fíor 5. Éifeacht chur i bhfeidhm eisgéineach L-ornithine ar phríomhmharcóirí struis ocsaídiúcháin agus meicníochtaí cosanta frithocsaídeacha neamh-einsímeacha i nduilleoga pónairí atá ionfhabhtaithe le S. sclerotiorum 72 uair an chloig tar éis ionfhabhtaithe faoi dhálaí cheaptha teasa. (A) Sárocsaíd hidrigine (H2O2; nmol g−1 FW) ag 72 hpt, (B) anion sárocsaíde (O2•−; nmol g−1 FW) ag 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) ag 72 hpt, (D) feinóil intuaslagtha iomlána (mg GAE g−1 FW) ag 72 hpt, (E) flavonoidí intuaslagtha iomlána (mg RE g−1 FW) ag 72 hpt, (F) aimínaigéid shaora iomlána (mg g−1 FW) ag 72 hpt, agus (G) cion próilín (mg g−1 FW) ag 72 hpt. Léiríonn na luachanna an meán ± an diall caighdeánach (meán ± SD) de 5 mhacasamhlú bitheolaíoch (n = 5). Léiríonn litreacha difriúla difríochtaí suntasacha ó thaobh staitisticí de idir chóireálacha (p < 0.05).