Thuairiscigh muid roimhe seo go bhfuil leibhéil serum an mheitibileit tryptophan díorthaithe ón gut, aigéad indole-3-propionic (IPA), níos ísle in othair a bhfuil fibróis ae orthu. Sa staidéar seo, rinneamar imscrúdú ar an transcriptome agus an meitilome DNA in ae murtallach i ndáil le leibhéil serum IPA, chomh maith le ról IPA i ndíghníomhachtú feinitíopach cealla stellate heipiteacha (HSCanna) a spreagadh in vitro.
Áiríodh sa staidéar 116 othar murtallach gan diaibéiteas mellitus cineál 2 (T2DM) (aois 46.8 ± 9.3 bliana; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) a ndearnadh obráid bhairiatrach orthu ag Ionad Máinliachta Bairiatrach Kuopio (KOBS). Tomhaiseadh leibhéil IPA imshruthaithe trí chrómatagrafaíocht leachtach-mais-speictriméadracht (LC-MS), rinneadh anailís trascríbhinní ae trí sheicheamhú iomlán RNA, agus rinneadh anailís meitileála DNA ag baint úsáide as an Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Baineadh úsáid as cealla stellate heipiteacha daonna (LX-2) le haghaidh turgnaimh in vitro.
Bhí leibhéil IPA serum comhghaolmhar le léiriú géinte a bhfuil baint acu le conairí aipoptotic, miotafagach, agus fad saoil san ae. Ba é an géin AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) an ghéin idirghníomhach is flúirseach agus is ceannasaí i dtrascríbhinn an ae agus i bpróifílí meitileála DNA. Spreag cóireáil IPA apoptosis, laghdaigh sí riospráid mitochondrial, agus d'athraigh sí moirfeolaíocht cille agus dinimic mitochondrial trí mhodhnú a dhéanamh ar léiriú géinte ar a bhfuil a fhios againn go rialaíonn siad fibróis, apoptosis, agus marthanacht cealla LX-2.
Le chéile, tacaíonn na sonraí seo leis an bhfíric go bhfuil éifeachtaí teiripeacha féideartha ag IPA agus gur féidir leis apoptosis a spreagadh agus an feinitíopa HSC a aistriú i dtreo staid neamhghníomhach, rud a leathnaíonn an fhéidearthacht go gcuirfear cosc ​​​​ar fhíobróis ae trí chur isteach ar ghníomhachtú HSC agus ar mheitibileacht mitochondrial.
Tá leitheadúlacht an otracht agus siondróm meitibileach nasctha le méadú ar mhinicíocht ghalar ae sailleach a bhaineann go meitibileach (MASLD); bíonn tionchar ag an ngalar ar 25% go 30% den daonra i gcoitinne [1]. Is é príomhiarmhairt eiteolaíocht MASLD ná fibróis ae, próiseas dinimiciúil arb iad is sainairíonna carnadh leanúnach maitrís eachtarcheallach snáithíneach (ECM) [2]. Is iad na príomhchealla atá bainteach le fibróis ae ná cealla stellate heipiteacha (HSCanna), a léiríonn ceithre feinitíop aitheanta: ciúin, gníomhachtaithe, neamhghníomhachtaithe, agus aosaithe [3, 4]. Is féidir HSCanna a ghníomhachtú agus tras-dhifreáil ó fhoirm chiúin go cealla iomadúla cosúil le fibroblast a bhfuil éilimh arda fuinnimh acu, le méadú ar léiriú α-aicitin matáin réidh (α-SMA) agus collaigine cineál I (Col-I) [5, 6]. Le linn aisiompú fibróis ae, déantar HSCanna gníomhachtaithe a dhíchur trí apoptosis nó neamhghníomhachtú. Áirítear leis na próisis seo laghdú ar ghéinte fibrogenacha agus modhnú géinte prosurvival (amhail conairí comharthaíochta NF-κB agus PI3K/Akt) [7, 8], chomh maith le hathruithe i ndinimic agus i bhfeidhm mitochondrial [9].
Fuarthas amach go laghdaítear leibhéil serum an mheitibileitíve tryptophan aigéad indole-3-propionic (IPA), a tháirgtear sa stéig, i ngalair meitibileacha daonna lena n-áirítear MASLD [10–13]. Tá baint ag IPA le hiontógáil snáithín aiste bia, tá sé ar eolas as a éifeachtaí frithocsaídeacha agus frith-athlastacha, agus laghdaíonn sé an feinitíopa steatoheipitíteas neamh-alcólach (NASH) a spreagtar ag aiste bia in vivo agus in vitro [11–14]. Tagann roinnt fianaise ónár staidéar roimhe seo, a léirigh go raibh leibhéil serum IPA níos ísle in othair a raibh fibróis ae orthu ná in othair murtallacha gan fibróis ae i Staidéar Máinliachta Bariatric Kuopio (KOBS). Ina theannta sin, léirigh muid gur féidir le cóireáil IPA léiriú géinte a laghdú ar marcóirí clasaiceacha iad maidir le greamaitheacht cille, imirce cille agus gníomhachtú gascheall hematopoietic i samhail cealla stellate hepatic daonna (LX-2) agus gur meitibilít heipitea-chosanta féideartha é [15]. Mar sin féin, níl sé soiléir fós conas a spreagann IPA aisiompú fibróis ae trí apoptosis HSC agus bithfhuinneamh mitochondrial a ghníomhachtú.
Anseo, léirímid go bhfuil baint ag IPA serum le léiriú géinte atá saibhrithe i gcosáin apoptosis, mitophagy, agus fad saoil in ae daoine atá murtallach ach nach bhfuil diaibéiteas cineál 2 (KOBS) orthu. Ina theannta sin, fuarthas amach gur féidir le IPA imréiteach agus díghrádú gaschealla hematopoietic gníomhachtaithe (HSCanna) a spreagadh tríd an gcosán díghníomhachtaithe. Nochtann na torthaí seo ról nua do IPA, rud a fhágann gur sprioc teiripeach ionchasach é chun aischéimniú fibróis ae a chur chun cinn.
Léirigh staidéar roimhe seo sa chohórt KOBS go raibh leibhéil IPA imshruthaithe níos ísle ag othair a raibh fibróis ae orthu i gcomparáid le hothair gan fibróis ae [15]. Chun an éifeacht mhearbhall féideartha a bhaineann le diaibéiteas cineál 2 a eisiamh, earcaíomar 116 othar murtallach gan diaibéiteas cineál 2 (meánaois ± SD: 46.8 ± 9.3 bliana; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tábla 1) ón staidéar KOBS atá ar siúl mar dhaonra an staidéir [16]. Thug na rannpháirtithe go léir toiliú feasach i scríbhinn agus cheadaigh Coiste Eitice Ospidéal Chontae Thuaisceart Savo prótacal an staidéir i gcomhréir le Dearbhú Heilsincí (54/2005, 104/2008 agus 27/2010).
Fuarthas eiseamail bhithóipse ae le linn obráid bariatrach agus rinne paiteolaithe a raibh taithí acu measúnú histeolaíoch orthu de réir na gcritéar a thuairiscíodh roimhe seo [17, 18]. Tá achoimre ar na critéir mheasúnaithe i dTábla Forlíontach S1 agus tá cur síos orthu roimhe seo [19].
Rinneadh anailís ar shamplaí serum troscadh trí chrómatagrafaíocht leachtach-mais-speictriméadracht neamhspriocdhírithe (LC-MS) le haghaidh anailíse meitibileachta (n = 116). Rinneadh anailís ar na samplaí ag baint úsáide as córas UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, an Ghearmáin) mar a thuairiscíodh roimhe seo19. Bhí sainaithint alcóil isopropile (IPA) bunaithe ar am coinneála agus comparáid idir an speictream MS/MS agus caighdeáin íona. Breithníodh déine an chomhartha IPA (achar buaice) i ngach anailís eile [20].
Rinneadh seicheamhú RNA an ae iomláin ag baint úsáide as Illumina HiSeq 2500 agus rinneadh réamhphróiseáil ar na sonraí mar a thuairiscíodh roimhe seo [19, 21, 22]. Rinneamar anailís spriocdhírithe ar léiriú difreálach ar thrascríbhinní a mbíonn tionchar acu ar fheidhm/bithghinéis mitochondrial ag baint úsáide as 1957 géin a roghnaíodh ón mbunachar sonraí MitoMiner 4.0 [23]. Rinneadh anailís meitiliúcháin DNA an ae ag baint úsáide as an Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, SAM) ag baint úsáide as an modheolaíocht chéanna a thuairiscíodh roimhe seo [24, 25].
Chuir an tOllamh Stefano Romeo cealla stellate heipiteacha daonna (LX-2) ar fáil go cineálta agus saothraíodh agus cothabháladh iad i meán DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Chun an dáileog oibre de IPA a roghnú, rinneadh cealla LX-2 a chóireáil le tiúchain éagsúla de IPA (10 μM, 100 μM agus 1 mM; Sigma, 220027) i meán DMEM/F12 ar feadh 24 uair an chloig. Ina theannta sin, chun cumas IPA chun HSCanna a dhíghníomhachtú a imscrúdú, rinneadh cealla LX-2 a chomhchóireáil le 5 ng/ml TGF-β1 (córais T&F, 240-B-002/CF) agus 1 mM IPA i meán saor ó shéiream ar feadh 24 uair an chloig. Maidir leis na rialuithe feithicle comhfhreagracha, úsáideadh 4 nM HCL ina raibh 0.1% BSA le haghaidh cóireála TGF-β1 agus úsáideadh 0.05% DMSO le haghaidh cóireála IPA, agus úsáideadh an dá cheann le chéile don chóireáil chomhcheangailte.
Rinneadh measúnú ar aipiptóis ag baint úsáide as an Trealamh Braite Aipiptóise FITC Annexin V le 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, SAM, Uimhir Chatalóige 640922) de réir threoracha an mhonaróra. Go hachomair, saothraíodh LX-2 (1 × 105 cealla/tobar) thar oíche i plátaí 12 thobar agus ansin rinneadh iad a chóireáil le dáileoga iolracha de IPA nó IPA agus TGF-β1. An lá dár gcionn, bailíodh cealla snámhacha agus greamaitheacha, rinneadh iad a thrípsiniú, a nite le PBS, a athfhionraí i maolán ceangailteach Annexin V, agus a ghoradh le FITC-Annexin V agus 7-AAD ar feadh 15 nóiméad.
Rinneadh mitochondria i gcealla beo a dhaiteadh le haghaidh gníomhaíochta ocsaídiúcháin ag baint úsáide as Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Le haghaidh aistí MTR, rinneadh cealla LX-2 a ghoradh ag dlúis chomhionanna le IPA agus TGF-β1. Tar éis 24 uair an chloig, rinneadh trypsiniú ar chealla beo, nite le PBS, agus ansin goradh iad le 100 μM MTR i meán saor ó serum ag 37 °C ar feadh 20 nóiméad mar a thuairiscíodh roimhe seo [26]. Chun anailís mhoirfeolaíochta cealla beo a dhéanamh, rinneadh anailís ar mhéid na gceall agus ar chastacht chíteaplasmach ag baint úsáide as paraiméadair scaipthe ar aghaidh (FSC) agus scaipthe taobh (SSC), faoi seach.
Fuarthas na sonraí go léir (30,000 imeacht) ag baint úsáide as NovoCyte Quanteon (Agilent) agus rinneadh anailís orthu ag baint úsáide as bogearraí NovoExpress® 1.4.1 nó FlowJo V.10.
Rinneadh tomhas ar an ráta tomhaltais ocsaigine (OCR) agus ar an ráta aigéadaithe eachtarcheallach (ECAR) i bhfíor-am ag baint úsáide as Anailíseoir Sreabhadh Eachtrachcheallach Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) a raibh Seahorse XF Cell Mito Stress feistithe air de réir threoracha an mhonaróra. Go hachomair, cuireadh 2 × 104 cealla/tobar LX-2 ar phlátaí cultúir cille XF96. Tar éis gorlainne thar oíche, rinneadh na cealla a chóireáil le isopropanol (IPA) agus TGF-β1 (Modhanna Forlíontacha 1). Rinneadh anailís sonraí ag baint úsáide as bogearraí Seahorse XF Wave, lena n-áirítear Gineadóir Tuairiscí Tástála Féinitíopa Fuinnimh Cille Seahorse XF. As seo, ríomhadh Innéacs Sláinte Bithfhuinnimh (BHI) [27].
Rinneadh tras-scríobh ar RNA iomlán i cDNA. Le haghaidh modhanna sonracha, féach tagairt [15]. Baineadh úsáid as leibhéil mRNA próitéin aigéadach ribeasómach 60S daonna P0 (RPLP0) agus cicloifilín A1 (PPIA) mar rialuithe géine bunreachtúla. Baineadh úsáid as Córas PCR Fíor-Ama QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, An Ísiltír) leis an TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) nó an Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), agus ríomhadh fillte choibhneasta géinléirithe ag baint úsáide as paraiméadair rothaíochta luach Ct comparáideacha (ΔΔCt) agus an modh ∆∆Ct. Soláthraítear sonraí na dtosaitheoirí i dTáblaí Forlíontacha S2 agus S3.
Baineadh DNA núicléach (ncDNA) agus DNA mitochondrial (mtDNA) ag baint úsáide as an trealamh fola agus fíocháin DNeasy (Qiagen) mar a thuairiscíodh roimhe seo [28]. Ríomhadh an méid coibhneasta mtDNA trí chóimheas gach réigiúin mtDNA sprice a ríomh leis an meán geoiméadrach de na trí réigiún DNA núicléach (mtDNA/ncDNA), mar atá mionsonraithe i Modhanna Forlíontacha 2. Soláthraítear sonraí na dtosaitheoirí le haghaidh mtDNA agus ncDNA i dTábla Forlíontach S4.
Rinneadh cealla beo a dhaite le Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) chun líonraí miteacoindreacha idircheallacha agus infhilleacha a shamhlú. Saothraíodh cealla LX-2 (1 × 104 cealla/tobar) ar shleamhnáin ghloine i plátaí cultúir bunghloine comhfhreagracha (Ibidi GmbH, Martinsried, an Ghearmáin). Tar éis 24 uair an chloig, goradh cealla beo LX-2 le 100 μM MTR ar feadh 20 nóiméad ag 37 °C agus daiteadh núicléis na gceall le DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) mar a thuairiscíodh roimhe seo [29]. Rinneadh líonraí miteacoindreacha a shamhlú ag baint úsáide as micreascóp inbhéartaithe Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, an Ghearmáin) a raibh modúl comhfhócasach Zeiss LSM 800 feistithe air ag 37 °C in atmaisféar taisithe le 5% CO2 ag baint úsáide as cuspóir 63 × NA 1.3. Fuaireamar deich n-íomhá sraith Z do gach cineál sampla. Tá 30 alt i ngach sraith Z, agus tiús 9.86 μm ag gach ceann acu. I gcás gach sampla, fuarthas íomhánna de dheich réimse radhairc éagsúla ag baint úsáide as bogearraí ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, an Ghearmáin), agus rinneadh anailís mhoirfeolaíochta mitochondrial ag baint úsáide as bogearraí ImageJ (v1.54d) [30, 31] de réir na bparaiméadar atá mionsonraithe i Modhanna Forlíontacha 3.
Socraíodh na cealla le 2% glútaraldehyde i maolán fosfáite 0.1 M, agus ina dhiaidh sin socraíodh iad le tuaslagán osmium teitreacsóide 1% (Sigma Aldrich, MO, SAM), díhiodráitíodh de réir a chéile iad le haicéatón (Merck, Darmstadt, an Ghearmáin), agus ar deireadh leabaithe i roisín eapocsa iad. Ullmhaíodh codanna ultrathanaí agus daiteadh iad le 1% aicéatáit úráinile (Merck, Darmstadt, an Ghearmáin) agus 1% citráit luaidhe (Merck, Darmstadt, an Ghearmáin). Fuarthas íomhánna ultrastruchtúracha ag baint úsáide as micreascóp leictreon tarchurtha JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tóiceo, an tSeapáin) ag voltas luasghéaraithe 80 kV.
Rinneadh anailís ar mhoirfeolaíocht na gcealla LX-2 a ndearnadh cóireáil orthu le IPA ar feadh 24 uair an chloig trí mhicreascópacht codarsnachta céime ag formhéadú 50x ag baint úsáide as micreascóp solais inbhéartaithe Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 agus AxioCam MRm, Jena, an Ghearmáin).
Léiríodh sonraí cliniciúla mar mheán ± diall caighdeánach nó airmheán (raon idircheathrúnach: IQR). Baineadh úsáid as anailís aontreo ar athraitheas (athróga leanúnacha) nó tástáil χ² (athróga catagóireacha) chun na difríochtaí idir na trí ghrúpa staidéir a chur i gcomparáid. Baineadh úsáid as an ráta dearfach bréagach (FDR) chun ceartú a dhéanamh le haghaidh tástálacha iolracha, agus measadh go raibh géinte le FDR < 0.05 suntasach go staitistiúil. Baineadh úsáid as anailís chomhghaolmhaireachta Spearman chun meitiliú DNA CpG a chomhghaolú le déine comhartha IPA, agus tuairiscíodh luachanna ainmniúla p (p < 0.05).
Rinneadh anailís conaire ag baint úsáide as uirlis anailíse tacair géinte gréasánbhunaithe (WebGestalt) le haghaidh 268 trascríbhinn (p ainmniúil < 0.01), 119 trascríbhinn a bhaineann le mitochondria (p ainmniúil < 0.05), agus 4350 CpG as 3093 trascríbhinn ae a raibh baint acu le leibhéil IPA serum imshruthaithe. Baineadh úsáid as an uirlis Venny DB (leagan 2.1.0) atá ar fáil saor in aisce chun géinte forluiteacha a aimsiú, agus baineadh úsáid as StringDB (leagan 11.5) chun idirghníomhaíochtaí próitéin-phróitéine a shamhlú.
I gcás turgnamh LX-2, rinneadh tástáil ar shamplaí le haghaidh gnáthachta ag baint úsáide as tástáil D'Agostino-Pearson. Fuarthas sonraí ó thrí mhacasamhlú bitheolaíocha ar a laghad agus rinneadh ANOVA aontreo orthu le tástáil iarchód Bonferroni. Measadh go raibh luach p níos lú ná 0.05 suntasach ó thaobh staitisticí de. Cuirtear sonraí i láthair mar mheán ± SD, agus léirítear líon na dturgnamh i ngach figiúr. Rinneadh na hanailísí agus na graif go léir ag baint úsáide as bogearraí staitistiúla GraphPad Prism 8 do Windows (GraphPad Software Inc., leagan 8.4.3, San Diego, SAM).
Ar dtús, rinneamar imscrúdú ar an gcomhlachas idir leibhéil IPA serum agus trascríbhinní an ae, an choirp iomláin, agus miteacoindreach. Sa phróifíl trascríbhinne iomlán, ba é MAPKAPK3 an ghéin ba láidre a raibh baint aici le leibhéil IPA serum (FDR = 0.0077; cíneas próitéine gníomhachtaithe miteagóine-cíneas próitéine gníomhachtaithe 3); sa phróifíl trascríbhinne a bhaineann le miteacoindreach, ba é AKT1 an ghéin ba láidre a raibh baint aici leis (FDR = 0.7621; cíneas seireáin/threonín AKT 1) (Comhad Breise 1 agus Comhad Breise 2).
Ansin rinneamar anailís ar thrascríbhinní domhanda (n = 268; p < 0.01) agus ar thrascríbhinní a bhaineann le mitochondria (n = 119; p < 0.05), agus sa deireadh thiar aithníomar gurbh é an apoptosis an bealach canónach is suntasaí (p = 0.0089). Maidir le trascríbhinní mitochondrial a bhaineann le leibhéil IPA serum, dhírigh muid ar apoptosis (FDR = 0.00001), mitofaga (FDR = 0.00029), agus bealaí comharthaíochta TNF (FDR = 0.000006) (Fíor 1A, Tábla 2, agus Fíoracha Forlíontacha 1A-B).
Anailís fhorluiteach ar thrascríbhinní domhanda, a bhaineann le mitochondria, agus meitiliú DNA in ae an duine i gcomhar le leibhéil IPA serum. Seasann A do 268 trascríbhinn dhomhanda, 119 trascríbhinn a bhaineann le mitochondria, agus trascríbhinní meitilithe DNA atá mapáilte chuig 3092 suíomh CpG a bhaineann le leibhéil IPA serum (luachanna p < 0.01 do thrascríbhinní domhanda agus DNA meitilithe, agus luachanna p < 0.05 do thrascríbhinní mitochondria). Taispeántar na príomh-trascríbhinní forluiteacha sa lár (AKT1 agus YKT6). B Tógadh léarscáil idirghníomhaíochta na 13 ghéin leis an scór idirghníomhaíochta is airde (0.900) le géinte eile ó na 56 ghéin fhorluiteacha (réigiún líne dubh) a raibh baint shuntasach acu le leibhéil IPA serum ag baint úsáide as an uirlis ar líne StringDB. Glas: Géinte mapáilte chuig an gcomhpháirt cheallacha Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). Is é AKT1 an próitéin leis an scór is airde (0.900) maidir le hidirghníomhaíochtaí le próitéiní eile bunaithe ar na sonraí (bunaithe ar mhianadóireacht téacs, turgnaimh, bunachair shonraí, agus comhléiriú). Léiríonn nóid líonra próitéiní, agus léiríonn imill naisc idir próitéiní.
Ós rud é gur féidir le meitibilítí micribhithe an ghoile comhdhéanamh eipiginéiteach a rialáil trí mheitileáil DNA [32], rinneamar imscrúdú ar cibé an raibh baint ag leibhéil IPA serum le meitileáil DNA ae. Fuaireamar amach go raibh an dá phríomhshuíomh meitileála a bhain le leibhéil IPA serum gar do réigiún saibhir próilín-serín 3 (C19orf55) agus ball 6 den teaghlach próitéine turraing teasa B (beag) (HSPB6) (Comhad breise 3). Bhí baint ag meitileáil DNA 4350 CpG (p < 0.01) le leibhéil IPA serum agus bhí sé saibhrithe i gcosáin rialála fad saoil (p = 0.006) (Fíor 1A, Tábla 2, agus Fíor Forlíontach 1C).
Chun na meicníochtaí bitheolaíocha atá mar bhunús leis na naisc idir leibhéil IPA serum, trascríbhinní domhanda, trascríbhinní a bhaineann le mitochondria, agus meitiliú DNA in ae an duine a thuiscint, rinneamar anailís forluí ar na géinte a sainaithníodh san anailís conaire roimhe seo (Fíor 1A). Léirigh torthaí na hanailíse saibhrithe conaire ar na 56 géin forluiteach (taobh istigh den líne dhubh i bhFíor 1A) gur aibhsigh an conair apoptosis (p = 0.00029) dhá ghéin atá coitianta sna trí anailís: AKT1 agus YKT6 (homalóg YKT6 v-SNARE), mar a thaispeántar sa léaráid Venn (Fíor Forlíontach 2 agus Fíor 1A). Is suimiúil an rud é, fuarthas amach go raibh AKT1 (cg19831386) agus YKT6 (cg24161647) comhghaolmhar go dearfach le leibhéil IPA serum (Comhad Breise 3). Chun idirghníomhaíochtaí próitéine féideartha idir táirgí géine a aithint, roghnaíomar 13 ghéin leis an scór réigiúin choitinn is airde (0.900) i measc 56 géin forluiteach mar ionchur agus thógamar léarscáil idirghníomhaíochta. De réir an leibhéil muiníne (muinín imeallach), bhí an géin AKT1 leis an scór is airde (0.900) ag an mbarr (Fíor 1B).
Bunaithe ar an anailís conaire, fuarthas amach gurbh é apoptosis an príomhbhealach, agus mar sin rinneamar imscrúdú ar cibé an mbeadh tionchar ag cóireáil IPA ar apoptosis HSCanna in vitro. Léirigh muid roimhe seo nach raibh dáileoga éagsúla de IPA (10 μM, 100 μM, agus 1 mM) tocsaineach do chealla LX-2 [15]. Léirigh an staidéar seo gur mhéadaigh cóireáil IPA ag 10 μM agus 100 μM líon na gcealla inmharthana agus necrotic. Mar sin féin, i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, laghdaigh inmharthanacht na gceall ag tiúchan 1 mM IPA, agus d'fhan an ráta necrosis cille gan athrú (Fíor 2A, B). Ansin, chun an tiúchan is fearr a aimsiú chun apoptosis a spreagadh i gcealla LX-2, rinneamar tástáil ar 10 μM, 100 μM, agus 1 mM IPA ar feadh 24 uair an chloig (Fíor 2A-E agus Fíor Forlíontach 3A-B). Is suimiúil gur laghdaigh IPA 10 μM agus 100 μM an ráta apoptosis (%), áfach, mhéadaigh IPA 1 mM an ráta apoptosis déanach agus apoptosis (%) i gcomparáid leis an rialú agus dá bhrí sin roghnaíodh é le haghaidh turgnaimh bhreise (Fíoracha 2A–D).
Spreagann IPA apoptosis cealla LX-2. Baineadh úsáid as modh dúbailte ruaimnithe Annexin V agus 7-AAD chun an ráta apoptóiseach agus moirfeolaíocht na gceall a chainníochtú trí chitiméadracht shreafa. Goradh cealla BA le 10 μM, 100 μM agus 1 mM IPA ar feadh 24 uair an chloig nó le F–H TGF-β1 (5 ng/ml) agus 1 mM IPA i meán saor ó serum ar feadh 24 uair an chloig. A: cealla beo (Annexin V -/ 7AAD-); B: cealla necrotic (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: luath (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: déanach (Annexin V+/7AAD.+); E, H: céatadán de chealla apoptóiseacha luatha agus déanacha iomlána sa ráta apoptóiseach (%). Léirítear sonraí mar mheán ± SD, n = 3 thurgnamh neamhspleách. Rinneadh comparáidí staitistiúla ag baint úsáide as ANOVA aontreo le tástáil iar-hoc Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Mar a léirigh muid roimhe seo, is féidir le 5 ng/ml TGF-β1 gníomhachtú HSC a spreagadh trí léiriú géinte marcóra clasaiceacha a mhéadú [15]. Rinneadh cealla LX-2 a chóireáil le 5 ng/ml TGF-β1 agus 1 mM IPA i gcomhcheangal (Fíor 2E–H). Níor athraigh cóireáil TGF-β1 an ráta apoptosis, áfach, mhéadaigh comhchóireáil IPA an ráta apoptosis déanach agus an ráta apoptosis (%) i gcomparáid le cóireáil TGF-β1 (Fíor 2E–H). Léiríonn na torthaí seo gur féidir le 1 mM IPA apoptosis a chur chun cinn i gcealla LX-2 go neamhspleách ar ionduchtú TGF-β1.
Rinneamar imscrúdú breise ar éifeacht IPA ar riospráid mitochondrial i gcealla LX-2. Léirigh na torthaí gur laghdaigh 1 mM IPA paraiméadair an ráta tomhaltais ocsaigine (OCR): riospráid neamh-mitochondrial, riospráid bonn agus uasta, sceitheadh ​​prótóin agus táirgeadh ATP i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (Fíor 3A, B), agus níor athraigh an t-innéacs sláinte bithfhuinnimh (BHI).
Laghdaíonn IPA riospráid mitochondrial i gcealla LX-2. Cuirtear cuar riospráide mitochondrial (OCR) i láthair mar pharaiméadair riospráide mitochondrial (riospráid neamh-mitochondrial, riospráid basal, riospráid uasta, sceitheadh ​​prótóin, giniúint ATP, SRC agus BHI). Goradh cealla A agus B le 10 μM, 100 μM agus 1 mM IPA ar feadh 24 uair an chloig, faoi seach. Goradh cealla C agus D le TGF-β1 (5 ng/ml) agus 1 mM IPA i meán saor ó serum ar feadh 24 uair an chloig, faoi seach. Rinneadh na tomhais uile a normalú go dtí ábhar DNA ag baint úsáide as an trealamh CyQuant. BHI: innéacs sláinte bithfhuinnimh; SRC: acmhainn chúltaca riospráide; OCR: ráta tomhaltais ocsaigine. Cuirtear sonraí i láthair mar mheán ± diall caighdeánach (SD), n = 5 turgnamh neamhspleách. Rinneadh comparáidí staitistiúla ag baint úsáide as tástáil ANOVA aontreo agus tástáil iar-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; agus ***p < 0.001
Chun tuiscint níos cuimsithí a fháil ar éifeacht IPA ar phróifíl bhithfhuinnimh cealla LX-2 atá gníomhachtaithe ag TGF-β1, rinneamar anailís ar fhosfaraileadh ocsaídiúcháin mitochondrial trí OCR (Fíor 3C,D). Léirigh na torthaí gur féidir le cóireáil TGF-β1 an t-riospráid uasta, an cumas cúltaca riospráide (SRC) agus BHI a laghdú i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (Fíor 3C,D). Ina theannta sin, laghdaigh an chóireáil chomhcheangailte riospráid bhunúsach, sceitheadh ​​prótóin agus táirgeadh ATP, ach bhí SRC agus BHI i bhfad níos airde ná iad siúd a ndearnadh cóireáil orthu le TGF-β1 (Fíor 3C,D).
Rinneamar an "Tástáil Féinitíopa Fuinnimh Cheallach" arna soláthar ag bogearraí Seahorse freisin (Fíor Fhorlíontach 4A–D). Mar a thaispeántar i bhFíor Fhorlíontach 3B, laghdaíodh acmhainneachtaí meitibileach OCR agus ECAR araon tar éis cóireála TGF-β1, ach níor breathnaíodh aon difríocht sna grúpaí cóireála teaglaim agus IPA i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe. Ina theannta sin, laghdaíodh leibhéil bhunúsacha agus struis OCR araon tar éis cóireála teaglaim agus IPA i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (Fíor Fhorlíontach 4C). Is suimiúil gur breathnaíodh patrún comhchosúil le teiripe teaglaim, áit nár breathnaíodh aon athrú ar leibhéil bhunúsacha agus struis ECAR i gcomparáid le cóireáil TGF-β1 (Fíor Fhorlíontach 4C). I HSCanna, níor athraigh an laghdú ar fhosfaraileadh ocsaídiúcháin mitochondrial agus cumas na cóireála teaglaim SCR agus BHI a athbhunú tar éis nochtadh do chóireáil TGF-β1 an poitéinseal meitibileach (OCR agus ECAR). Le chéile, léiríonn na torthaí seo gur féidir le IPA bithfhuinneamh a laghdú i HSCanna, rud a thugann le fios gur féidir le IPA próifíl fhuinniúil níos ísle a spreagadh a aistríonn an feinitíopa HSC i dtreo neamhghníomhachtaithe (Fíor Fhorlíontach 4D).
Rinneadh imscrúdú ar éifeacht IPA ar dhinimic mitochondrial trí úsáid a bhaint as cainníochtú tríthoiseach ar mhórfhoirmiú mitochondrial agus naisc líonra chomh maith le staining MTR (Fíor 4 agus Fíor Forlíontach 5). Léiríonn Fíor 4, i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, gur laghdaigh cóireáil TGF-β1 an meánachar dromchla, líon na mbrainsí, fad iomlán na mbrainsí, agus líon acomhal na mbrainsí (Fíor 4A agus B) agus gur athraigh sí cion na mitochondria ó mhórfhoirmiú sféarúil go mórfhoirmiú idirmheánach (Fíor 4C). Níor laghdaigh ach cóireáil IPA an meántoirt mitochondrial agus gur athraigh sí cion na mitochondria ó mhórfhoirmiú sféarúil go mórfhoirmiú idirmheánach i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (Fíor 4A). I ​​gcodarsnacht leis sin, níor athraigh sféarúlacht, meánfhad na mbrainsí, agus gníomhaíocht mitochondrial a measúnaíodh le MTR atá ag brath ar phoitéinseal membrane mitochondrial (Fíor 4A agus E) agus ní raibh aon difríocht idir na paraiméadair seo idir na grúpaí. Le chéile, tugann na torthaí seo le fios go bhfuil an chuma ar an scéal go modhnaíonn cóireáil TGF-β1 agus IPA cruth agus méid mitochondrial chomh maith le castacht líonra i gcealla beo LX-2.
Athraíonn IPA dinimic mitochondrial agus flúirse DNA mitochondrial i gcealla LX-2. A. Íomhánna comhfhócasacha ionadaíocha de chealla LX-2 beo atá goraithe le TGF-β1 (5 ng/ml) agus 1 mM IPA ar feadh 24 uair an chloig i meán saor ó serum a thaispeánann líonraí mitochondrial daite le Mitotracker™ Red CMXRos agus núicléis daite gorm le DAPI. Bhí 15 íomhá ar a laghad in aghaidh an ghrúpa sna sonraí go léir. Fuaireamar 10 íomhá Z-stack do gach cineál sampla. Bhí 30 slisne i ngach seicheamh Z-ais, agus tiús 9.86 μm ag gach ceann acu. Barra scála: 10 μm. B. Réada ionadaíocha (mitochondria amháin) a sainaithníodh trí thairseach oiriúnaitheach a chur i bhfeidhm ar an íomhá. Rinneadh anailís chainníochtúil agus comparáid idir naisc líonra moirfeolaíocha mitochondrial do gach cealla i ngach grúpa. C. Minicíocht cóimheasa cruth mitochondrial. Léiríonn luachanna gar do 0 cruthanna sféarúla, agus léiríonn luachanna gar do 1 cruthanna filiméadacha. D Cinneadh ábhar DNA mitochondrial (mtDNA) mar a thuairiscítear in Ábhair agus Modhanna. Rinneadh anailís ar E Mitotracker™ Red CMXRos trí shreabhchitiméadracht (30,000 imeacht) mar a thuairiscítear in Ábhair agus Modhanna. Cuirtear sonraí i láthair mar mheán ± SD, n = 3 thurgnamh neamhspleách. Rinneadh comparáidí staitistiúla ag baint úsáide as ANOVA aontreo agus tástáil iar-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Ansin rinneamar anailís ar an ábhar mtDNA i gcealla LX-2 mar tháscaire ar líon mitochondrial. I gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, bhí méadú ar an ábhar mtDNA sa ghrúpa a ndearnadh cóireáil orthu le TGF-β1 (Fíor 4D). I gcomparáid leis an ngrúpa a ndearnadh cóireáil orthu le TGF-β1, bhí laghdú ar an ábhar mtDNA sa ghrúpa cóireála teaglaim (Fíor 4D), rud a thugann le fios go bhféadfadh IPA an t-ábhar mtDNA agus b'fhéidir líon mitochondrial chomh maith le riospráid mitochondrial a laghdú (Fíor 3C). Thairis sin, is cosúil gur laghdaigh IPA an t-ábhar mtDNA sa chóireáil teaglaim ach ní raibh tionchar aige ar ghníomhaíocht mitochondrial a mhargaíodh le MTR (Fíor 4A–C).
Rinneamar imscrúdú ar an gcomhlachas idir IPA agus leibhéil mRNA géinte a bhaineann le fibróis, aipeaptóis, marthanacht, agus dinimic mitochondrial i gcealla LX-2 (Fíor 5A–D). I gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, léirigh an grúpa a ndearnadh cóireáil air le TGF-β1 méadú ar léiriú géinte amhail slabhra α2 cineál I collaigine (COL1A2), achtin matáin réidh α-(αSMA), maitrís metalloproteinase 2 (MMP2), coscaire fíocháin metalloproteinase 1 (TIMP1), agus géin cosúil le dynamin 1 (DRP1), rud a léiríonn méadú ar fhíobróis agus ar ghníomhachtú. Ina theannta sin, i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, laghdaigh cóireáil TGF-β1 leibhéil mRNA gabhdóra pregnane X núicléach (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, coscaire cealla-B α, feabhsaitheoir peiptíde solais géine fachtóra núicléach κ (NFκB1A), agus coscaire fho-aonad cínáis fachtóra núicléach κB β (IKBKB) (Fíor 5A–D). I gcomparáid le cóireáil TGF-β1, laghdaigh cóireáil chomhcheangailte le TGF-β1 agus IPA léiriú COL1A2 agus MMP2, ach mhéadaigh sí leibhéil mRNA PXR, TIMP1, liomfóma cille-B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, agus IKBKB. Laghdaigh cóireáil IPA léiriú MMP2, próitéin X a bhaineann le Bcl-2 (BAX), AKT1, próitéin atrophy optúil 1 (OPA1), agus próitéin chomhleá mitochondrial 2 (MFN2) go suntasach, ach mhéadaigh léiriú CASP8, NFκB1A, NFκB1B, agus IKBKB i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe. Mar sin féin, ní bhfuarthas aon difríocht i léiriú caspase-3 (CASP3), fachtóir gníomhachtaithe peiptídáis apoptotic 1 (APAF1), próitéin chomhleá mitochondrial 1 (MFN1), agus próitéin scoilte 1 (FIS1). Le chéile, tugann na torthaí seo le fios go modhnaíonn cóireáil IPA léiriú géinte a bhaineann le fibróis, aipeaptóis, marthanacht, agus dinimic mitochondrial. Tugann ár sonraí le fios go laghdaíonn cóireáil IPA fibróis i gcealla LX-2; ag an am céanna, spreagann sé marthanacht tríd an bhféinítóip a aistriú i dtreo neamhghníomhachtaithe.
Modhnaíonn IPA léiriú géinte fibroblast, apoptotic, inmharthanachta, agus dinimic mitochondrial i gcealla LX-2. Taispeánann histeagraim léiriú mRNA i gcoibhneas le rialú endogenous (RPLP0 nó PPIA) tar éis cealla LX-2 a spreagadh le TGF-β1 agus IPA i meán saor ó serum ar feadh 24 uair an chloig. Léiríonn A fibroblasts, léiríonn B cealla apoptotic, léiríonn C cealla marthanacha, agus léiríonn D léiriú géine dinimic mitochondrial. Cuirtear sonraí i láthair mar mheán ± diall caighdeánach (SD), n = 3 thurgnamh neamhspleách. Rinneadh comparáidí staitistiúla ag baint úsáide as ANOVA aontreo agus tástáil iar-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Ansin, rinneadh measúnú ar athruithe i méid na gceall (FSC-H) agus ar chastacht chíteaplasmach (SSC-H) trí shreabhchíteiméadracht (Fíor 6A,B), agus rinneadh measúnú ar athruithe i moirfeolaíocht na gceall tar éis cóireála IPA trí mhicreascópacht leictreon tarchurtha (TEM) agus micreascópacht codarsnachta céime (Fíor Forlíontach 6A-B). Mar a bhíothas ag súil leis, mhéadaigh méid na gceall sa ghrúpa a ndearnadh cóireáil orthu le TGF-β1 i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (Fíor 6A,B), rud a léiríonn leathnú clasaiceach an reitineal endoplasmach garbh (ER*) agus na bhfagóilisóim (P), rud a léiríonn gníomhachtú gaschealla hematopoietic (HSC) (Fíor Forlíontach 6A). Mar sin féin, i gcomparáid leis an ngrúpa a ndearnadh cóireáil orthu le TGF-β1, laghdaíodh méid na gceall, castacht chíteaplasmach (Fíor 6A,B), agus ábhar ER* sa ghrúpa cóireála teaglaim TGF-β1 agus IPA (Fíor Forlíontach 6A). Ina theannta sin, laghdaigh cóireáil IPA méid na gceall, castacht chíteaplasmach (Fíor 6A,B), ábhar P agus ER* (Fíor Forlíontach 6A) i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe. Ina theannta sin, mhéadaigh cion na gcealla aipiptóiseacha tar éis 24 uair an chloig de chóireáil IPA i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (saigheada bána, Fíor Fhorlíontach 6B). Le chéile, tugann na torthaí seo le fios gur féidir le 1 mM IPA aipiptóis HSC a spreagadh agus na hathruithe i bparaiméadair mhórfeolaíocha cille arna spreagadh ag TGF-β1 a aisiompú, rud a rialaíonn méid agus castacht na gceall, rud a d'fhéadfadh a bheith bainteach le díghníomhachtú HSC.
Athraíonn IPA méid na gceall agus castacht an chíteaplasma i gcealla LX-2. Íomhánna ionadaíocha d'anailís sreafa-chíteamaitreachta. Bhain an anailís úsáid as straitéis geataithe a bhí sainiúil do chealla LX-2: SSC-A/FSC-A chun daonra na gceall a shainiú, FSC-H/FSC-A chun dúbailtí a aithint, agus SSC-H/FSC-H le haghaidh anailíse ar mhéid agus ar chastacht na gceall. Goradh cealla le TGF-β1 (5 ng/ml) agus 1 mM IPA i meán saor ó shéiream ar feadh 24 uair an chloig. Dáileadh cealla LX-2 sa cheathrú íochtarach ar chlé (SSC-H-/FSC-H-), sa cheathrú uachtarach ar chlé (SSC-H+/FSC-H-), sa cheathrú íochtarach ar dheis (SSC-H-/FSC-H+), agus sa cheathrú uachtarach ar dheis (SSC-H+/FSC-H+) le haghaidh anailíse ar mhéid na gceall agus ar chastacht an chíteaplasma. B. Rinneadh anailís ar mhoirfeolaíocht na gceall trí shreafa-chíteamaitreachta ag baint úsáide as FSC-H (scaipeadh ar aghaidh, méid na gceall) agus SSC-H (scaipeadh taobh, castacht an chíteaplasma) (30,000 imeacht). Cuirtear na sonraí i láthair mar mheán ± SD, n = 3 thurgnamh neamhspleách. Rinneadh comparáidí staitistiúla ag baint úsáide as ANOVA aontreo agus tástáil iar-hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 agus ****p < 0.0001
Tá meitibilítí gut ar nós IPA ina dtéama te taighde, rud a thugann le fios go bhféadfaí spriocanna nua a fhionnadh i micribhithe gut. Dá bhrí sin, is suimiúil gur léiríodh gur féidir le IPA, meitibilít atá nasctha againn le fibróis ae i ndaoine [15], a bheith ina chomhdhúil frith-fibróiseach i samhlacha ainmhithe [13, 14]. Anseo, léirímid den chéad uair nasc idir IPA serum agus transcriptomics domhanda ae agus meitiliú DNA i ndaoine murtallacha gan diaibéiteas cineál 2 (T2D), ag béim ar apoptosis, mitophagy agus fad saoil, chomh maith le géine AKT1 iarrthóir féideartha a rialaíonn homeostasis ae. Nuálaíocht eile inár staidéar ná gur léiríomar idirghníomhaíocht cóireála IPA le apoptosis, moirfeolaíocht cille, bithfhuinneamh mitochondrial agus dinimic i gcealla LX-2, rud a léiríonn speictream fuinnimh níos ísle a aistríonn feinitíopa HSC i dtreo neamhghníomhachtaithe, rud a fhágann gur iarrthóir ionchasach é IPA chun fibróis ae a fheabhsú.
Fuaireamar amach gurbh iad aipiptóis, miotófaga agus fad saoil na conairí canónacha is tábhachtaí a raibh saibhriú iontu i ngéinte ae a bhaineann le IPA serum imshruthaithe. Is féidir le cur isteach ar an gcóras rialaithe cáilíochta mitochondrial (MQC) mífheidhm mitochondrial, miotófaga agus aipiptóis a bheith mar thoradh air, rud a chuireann le tarlú MASLD[33, 34]. Dá bhrí sin, is féidir linn a thomhas go bhféadfadh IPA a bheith páirteach i gcothabháil dinimic cille agus sláine mitochondrial trí aipiptóis, miotófaga agus fad saoil san ae. Léirigh ár sonraí go raibh dhá ghéin coitianta sna trí thástáil: YKT6 agus AKT1. Is fiú a thabhairt faoi deara gur próitéin SNARE é YKT6 atá páirteach i bpróiseas comhleá membrane cille. Tá ról aige in autophagy agus mitophagy trí choimpléasc tionscnaimh a fhoirmiú le STX17 agus SNAP29 ar an autophagosome, rud a chuireann le comhleá autophagosomes agus lysosomes[35]. Ina theannta sin, bíonn lagú ar mitofaga mar thoradh ar chailliúint fheidhm YKT6[36], agus tá baint ag uasrialáil YKT6 le dul chun cinn carcanama heipiteacheallach (HCC), rud a léiríonn méadú ar mharthanas cille[37]. Ar an láimh eile, is é AKT1 an géin idirghníomhach is tábhachtaí agus tá ról tábhachtach aige i ngalair ae, lena n-áirítear cosán comharthaíochta PI3K/AKT, timthriall cille, imirce cille, iomadú, greamaitheacht fócasach, feidhm mitochondrial, agus secretion collaigine[38–40]. Is féidir le cosán comharthaíochta PI3K/AKT gníomhachtaithe gaschealla hematopoietic (HSCanna) a ghníomhachtú, arb iad na cealla iad atá freagrach as táirgeadh maitrís eachtarcheallach (ECM), agus féadfaidh a mhírialú cur le tarlú agus dul chun cinn fibróis ae[40]. Ina theannta sin, tá AKT ar cheann de na príomhfhachtóirí marthanais cille a chuireann cosc ​​ar apoptosis cille atá ag brath ar p53, agus féadfaidh gníomhachtú AKT a bheith bainteach le cosc ​​ar apoptosis cille ae[41, 42]. Tugann na torthaí a fuarthas le fios go bhféadfadh IPA a bheith páirteach in apoptosis a bhaineann le mitochondria ae trí thionchar a imirt ar chinneadh heipitocítí idir dul isteach in apoptosis nó maireachtáil. Féadfaidh géinte iarrthóra AKT agus/nó YKT6 na héifeachtaí seo a rialáil, atá ríthábhachtach do homeostasis ae.
Léirigh ár dtorthaí gur spreag 1 mM IPA apoptosis agus gur laghdaigh sé riospráid mitochondrial i gcealla LX-2 neamhspleách ar chóireáil TGF-β1. Is fiú a thabhairt faoi deara gur príomhbhealach é apoptosis chun fibróis a réiteach agus gaschealla hematopoietic (HSC) a ghníomhachtú, agus gur imeacht ríthábhachtach é freisin i bhfreagairt fhiseolaíoch inchúlaithe fibróis ae [4, 43]. Thairis sin, thug athchóiriú BHI i gcealla LX-2 tar éis cóireála teaglaim léargas nua ar ról féideartha IPA i rialáil bithfhuinnimh mitochondrial. Faoi dhálaí scíthe agus neamhghníomhacha, úsáideann cealla hematopoietic fosfaraileadh ocsaídiúcháin mitochondrial de ghnáth chun ATP a tháirgeadh agus bíonn gníomhaíocht meitibileach íseal acu. Ar an láimh eile, feabhsaíonn gníomhachtú HSC riospráid agus bithshintéis mitochondrial chun cúiteamh a dhéanamh as na héilimh fuinnimh a bhaineann le dul isteach sa stát glicealaíoch [44]. Tugann an fhíric nár chuir IPA isteach ar an acmhainneacht meitibileach agus ECAR le fios nach bhfuil an oiread tosaíochta ag an gcosán glicealaíoch. Ar an gcaoi chéanna, léirigh staidéar eile gur éirigh le 1 mM IPA gníomhaíocht slabhra riospráide mitochondrial a mhodhnú i gcardaimiicítí, líne cille heipiticítí daonna (Huh7) agus cealla endothelial féith imleacáin dhaonna (HUVEC); Mar sin féin, ní bhfuarthas aon éifeacht ag IPA ar ghlicóláis i gcairdimiicítí, rud a thugann le fios go bhféadfadh IPA difear a dhéanamh do bhithfhuinneamh cineálacha eile cealla [45]. Dá bhrí sin, táimid ag tuairimíocht go bhféadfadh 1 mM IPA gníomhú mar dhícheangaltóir ceimiceach éadrom, ós rud é gur féidir leis léiriú géine fibrogenic, moirfeolaíocht cille agus bithfhuinneamh mitochondrial a laghdú go suntasach gan méid an mtDNA a athrú [46]. Is féidir le dícheangaltóirí mitochondrial fibróis spreagtha ag cultúr agus gníomhachtú HSC a chosc [47] agus táirgeadh ATP mitochondrial a laghdú atá rialaithe nó spreagtha ag próitéiní áirithe amhail próitéiní dícheangailte (UCP) nó traslocase núicléatíde adenine (ANT). Ag brath ar an gcineál cille, is féidir leis an bhfeiniméan seo cealla a chosaint ó apoptosis agus/nó apoptosis a chur chun cinn [46]. Mar sin féin, tá gá le tuilleadh staidéir chun ról IPA mar dhícheangaltóir mitochondrial i ndíghníomhachtú gaschealla hematopoietic a shoiléiriú.
Ansin rinneamar imscrúdú ar cé acu a léirítear na hathruithe ar riospráid mitochondrial i moirfeolaíocht mitochondrial i gcealla beo LX-2. Is suimiúil go n-athraíonn cóireáil TGF-β1 an cion mitochondrial ó sféarúil go idirmheánach, le laghdú ar bhrainseáil mitochondrial agus méadú ar léiriú DRP1, fachtóir ríthábhachtach i scoilteadh mitochondrial [48]. Ina theannta sin, tá baint ag ilroinnt mitochondrial le castacht iomlán an líonra, agus tá an t-aistriú ó chomhleá go scoilteadh ríthábhachtach le haghaidh gníomhachtú gaschealla hematopoietic (HSC), ach bíonn apoptosis HSC mar thoradh ar chosc ar scoilteadh mitochondrial [49]. Dá bhrí sin, léiríonn ár dtorthaí gur féidir le cóireáil TGF-β1 laghdú ar chastacht líonra mitochondrial a spreagadh le laghdú ar bhrainseáil, rud atá níos coitianta i scoilteadh mitochondrial a bhaineann le gaschealla hematopoietic gníomhachtaithe (HSCanna). Ina theannta sin, léirigh ár sonraí gur féidir le IPA cion na mitochondria a athrú ó chruth sféarúil go cruth idirmheánach, rud a laghdaíonn léiriú OPA1 agus MFN2. Léirigh staidéir gur féidir le laghdú ar OPA1 laghdú a chur faoi deara i gcumas membrane mitochondrial agus apoptosis cille a spreagadh [50]. Is eol go ndéanann MFN2 comhleá mitochondrial agus apoptosis a idirghabháil [51]. Tugann na torthaí a fuarthas le fios go bhfuil an chuma ar an scéal go modhnaíonn ionduchtú cealla LX-2 ag TGF-β1 agus/nó IPA cruth agus méid mitochondrial, chomh maith le staid ghníomhachtaithe agus castacht an líonra.
Léiríonn ár dtorthaí gur féidir le cóireáil chomhcheangailte TGFβ-1 agus IPA paraiméadair mhoirfeolaíocha mtDNA agus cille a laghdú trí rialáil a dhéanamh ar léiriú mRNA géinte fibróise, apoptosis agus géinte a bhaineann le marthanacht i gcealla a sheachnaíonn apoptosis. Go deimhin, laghdaigh IPA leibhéal léiriú mRNA AKT1 agus géinte fibróise tábhachtacha ar nós COL1A2 agus MMP2, ach mhéadaigh sé leibhéal léiriú CASP8, atá bainteach le apoptosis. Léirigh ár dtorthaí, tar éis cóireála IPA, gur laghdaigh léiriú BAX agus gur mhéadaigh léiriú mRNA fho-aonaid teaghlaigh TIMP1, BCL-2 agus NF-κB, rud a thugann le fios gur féidir le IPA comharthaí marthanais a spreagadh i gcealla gas hematopoietic (HSCanna) a sheachnaíonn apoptosis. Féadfaidh na móilíní seo gníomhú mar chomharthaí pro-mharthanais i gcealla gas hematopoietic gníomhachtaithe, a d'fhéadfadh a bheith bainteach le méadú ar léiriú próitéiní frith-apoptosis (ar nós Bcl-2), laghdú ar léiriú BAX pro-apoptosis, agus idirghníomhaíocht chasta idir TIMP agus NF-κB [5, 7]. Cuireann IPA a éifeachtaí i bhfeidhm trí PXR, agus fuarthas amach gur mhéadaigh cóireáil chomhcheangailte le TGF-β1 agus IPA leibhéil léirithe mRNA PXR, rud a léiríonn cosc ​​ar ghníomhachtú HSC. Is eol go gcuireann comharthaíocht PXR gníomhachtaithe cosc ​​ar ghníomhachtú HSC in vivo agus in vitro araon [52, 53]. Léiríonn ár dtorthaí go bhféadfadh IPA páirt a ghlacadh i nglanadh HSCanna gníomhachtaithe trí apoptosis a chur chun cinn, fibrosis agus meitibileacht mitochondrial a laghdú, agus comharthaí marthanais a fheabhsú, ar próisis tipiciúla iad a athraíonn an feinitíopa HSC gníomhachtaithe go ceann neamhghníomhachtaithe. Míniú eile a d'fhéadfadh a bheith ar an meicníocht agus an ról féideartha atá ag IPA in apoptosis ná go ndéanann sé scavenge mitochondria mífheidhmiúil go príomha trí mitophagy (conair intreach) agus an conair chomharthaíochta TNF seachtrach (Tábla 1), atá nasctha go díreach leis an gcosán comharthaíochta marthanais NF-κB (Fíor Forlíontach 7). Is suimiúil go bhfuil géinte saibhrithe a bhaineann le IPA in ann comharthaí pro-apoptotic agus pro-mharthanais a spreagadh sa chonair apoptotic [54], rud a thugann le fios go bhféadfadh IPA an cosán apoptotic nó marthanacht a spreagadh trí idirghníomhú leis na géinte seo. Mar sin féin, níl sé soiléir fós conas a spreagann IPA apoptosis nó marthanacht le linn gníomhachtú HSC agus a chosáin mheicníochta.
Is meitibilít miocróbach é IPA a fhoirmítear ó thríptofán aiste bia tríd an micribhithe gut. Léirigh staidéir go bhfuil airíonna frith-athlastacha, frithocsaídeacha, agus rialála eipiginéiteacha aige sa timpeallacht intestinal.[55] Léirigh staidéir gur féidir le IPA feidhm bhacainn intestinal a mhodhnú agus strus ocsaídiúcháin a laghdú, rud a d'fhéadfadh cur lena éifeachtaí fiseolaíocha áitiúla.[56] Déanta na fírinne, iompraítear IPA chuig orgáin sprice tríd an gcúrsaíocht, agus ós rud é go roinneann IPA struchtúr meitibilít mór cosúil le díorthaigh thríptofán, serotonin, agus indole, feidhmíonn IPA gníomhartha meitibileach as a dtagann cinniúint meitibileach iomaíoch.[52] Féadfaidh IPA dul san iomaíocht le meitibilítí díorthaithe ó thríptofán le haghaidh suíomhanna ceangailteach ar einsímí nó gabhdóirí, rud a d'fhéadfadh cur isteach ar chonairí meitibileach gnáth. Leagann sé seo béim ar an ngá atá le tuilleadh staidéir ar a chógaschinéitic agus a chógasdinimic chun tuiscint níos fearr a fháil ar a fhuinneog theiripeach.[57] Ní fios fós an féidir leis seo tarlú i gcealla gas hematopoietic (HSCanna) freisin.
Aithnímid go bhfuil roinnt teorainneacha ag baint lenár staidéar. Chun naisc a bhaineann le IPA a scrúdú go sonrach, eisiamh muid othair a bhfuil diaibéiteas mellitus cineál 2 (T2DM) orthu. Aithnímid go gcuireann sé seo teorainn le hinfheidhmeacht leathan ár dtorthaí maidir le hothair a bhfuil diaibéiteas mellitus cineál 2 agus galar ae chun cinn orthu. Cé go bhfuil tiúchan fiseolaíoch IPA i serum daonna 1–10 μM [11, 20], roghnaíodh tiúchan 1 mM IPA bunaithe ar an tiúchan neamh-tocsaineach is airde [15] agus an ráta apoptosis is airde, gan aon difríocht i gcéatadán an daonra cealla néacrótacha. Cé gur úsáideadh leibhéil fhorfhiseolaíocha IPA sa staidéar seo, níl aon chomhdhearcadh ann faoi láthair maidir leis an dáileog éifeachtach de IPA [52]. Cé go bhfuil ár dtorthaí suntasach, is réimse taighde gníomhach é cinniúint meitibileach níos leithne IPA. Thairis sin, fuarthas ár dtorthaí ar an nasc idir leibhéil IPA serum agus meitiliú DNA trascríbhinní ae ní hamháin ó chealla gas hematopoietic (HSCanna) ach ó fhíocháin ae freisin. Roghnaíomar cealla daonna LX-2 a úsáid bunaithe ar ár dtorthaí roimhe seo ó anailís transcriptome a léiríonn go bhfuil baint ag IPA le gníomhachtú gaschealla hematopoietic (HSC) [15], agus gurb iad HSCanna na príomhchealla atá bainteach le dul chun cinn fibróis ae. Tá an t-ae comhdhéanta de chineálacha cealla iolracha, mar sin ba cheart samhlacha cealla eile amhail córas comhchultúir heipiteacít-HSC-cealla imdhíonachta in éineacht le gníomhachtú caspase agus ilroinnt DNA chomh maith leis an meicníocht gníomhaíochta lena n-áirítear leibhéal próitéine a bhreithniú chun ról IPA agus a idirghníomhaíocht le cineálacha cealla ae eile a staidéar.