Tá sórtáil próitéine sa chonair rúnda riachtanach chun urrannú cille agus homeostasis a chothabháil. Chomh maith le sórtáil trí bhlaosc, is ceist bhunúsach fadbhunaithe í ról lipidí i sórtáil kinesin sa phróiseas iompair rúnda nach bhfuil freagraithe fós. Anseo, déanaimid íomháú fíor-ama il-dhathach ardtaifigh comhuaineach 3T chun a chruthú in vivo go bhfuil próitéiní glúcósailphosphatidylinositol atá nua-shintéisithe agus a bhfuil comhpháirteanna lipid ceramide an-fhada acu braislithe agus aicmithe i suíomh imeachta glan endoplasmaí speisialaithe, atá difriúil ón gceann a úsáideann próitéiní trasmembrane. Ina theannta sin, taispeánaimid go bhfuil fad slabhra ceramide i scannán an reitineal endoplasmach ríthábhachtach don roghnaíocht sórtála seo. Soláthraíonn ár staidéar an chéad fhianaise dhíreach in vivo chun lastais próitéine a aicmiú bunaithe ar fhad slabhra lipid i suíomhanna onnmhairithe roghnacha sa chonair rúnda.
I gcealla eocarótacha, déantar na próitéiní a shintéisítear sa reitin endoplasmach (ER) a shórtáil le linn iompair tríd an gcosán rúnda le seachadadh chuig a gceann scríbe ceallach cuí (1). Chomh maith le sórtáil trí chóta, bhíothas ag tuairimíocht le fada gur féidir le lipidí áirithe feidhmiú mar phointí imeachta roghnacha trí iad a ghrúpáil i bhfearann ​​​​membrane sonracha a dhéanann próitéiní sonracha (2-5). Mar sin féin, tá easpa fianaise dhírigh in vivo ann fós chun an mheicníocht seo atá bunaithe ar lipidí a chruthú. Chun an fhadhb bhunúsach seo a réiteach, rinneamar staidéar i giosta ar an gcaoi a n-onnmhairítear próitéiní ancaire glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) go difriúil ón ER. Is éagsúlacht próitéiní dromchla cille atá ceangailte le lipidí iad GPI-APs (6, 7). Is próitéin rúnda é GPI-AP atá ceangailte le bileoga seachtracha an membrane plasma tríd an gcuid glycolipid (ancaire GPI). Glacann siad le hancairí GPI mar mhodhnuithe coimeádacha iar-aistriúcháin i lumen an ER (8). Tar éis ceangail, téann GPI-AP tríd an gaireas Golgi (5, 9) ón ER go dtí an membrane plasma. Fágann láithreacht ancairí GPI go n-iompraítear GPI-AP ar leithligh ó phróitéiní rúnda trasmembrane (lena n-áirítear próitéiní membrane plasma eile) feadh an chosáin rúnda (5, 9, 10). I gcealla giosta, déantar GPI-APanna a dheighilt ó phróitéiní rúnda eile sa reitin endoplasmach, agus ansin pacáistítear iad i veicilí uathúla atá fillte ag coimpléasc próitéine cóta II (COPII) (6, 7). Níl cinntitheoirí an phróisis aicmithe seo i bpróiseas easpórtála an ER soiléir, ach meastar go bhféadfadh lipidí a bheith ag teastáil ón meicníocht seo, go háirithe athmhúnlú struchtúrach ar chuid lipid ancaire GPI (5, 8). I giosta, tosaíonn athmhúnlú lipid GPI díreach tar éis don GPI ceangal, agus i go leor cásanna, fágann sé go gceanglaíonn ceirimíd leis an aigéad sailleach sáithithe slabhra fada 26-charbóin (C26:0) (11, 12). Is é ceramide C26 an príomh-cheramide a tháirgeann cealla giosta go dtí seo. Déantar é a shintéisiú san ER agus onnmhairítear an chuid is mó de chuig an gaireas Golgi trí veicilí COPII (13). Éilíonn onnmhairiú GPI-AP san ER sintéis leanúnach ceramide (14, 15), agus ina dhiaidh sin, braitheann comhshó ceramide go ceramide fosfáit inositol (IPC) san fhearas Golgi ar shintéis ancaire GPI (16). Léirigh staidéir bhithfhisiceacha le scannáin shaorga gur féidir le ceramides slabhra acyl an-fhada teacht le chéile chun fearainn ordaithe a fhoirmiú le hairíonna fisiceacha uathúla (17, 18). Mar thoradh ar na sonraí seo, tagann an hipitéis chun cinn go n-úsáideann ceramide C26 agus GPI-AP le ceramide C26 a n-airíonna fisiceacha chun teacht le chéile i réigiúin nó réigiúin ordúla i dtimpeallacht lipid membrane ER atá sách neamhrialta. Tá sé comhdhéanta den chuid is mó de ghlicriolipidí gearra agus neamhsháithithe (C16:1 agus C18:1) (19, 20). Díreofar na réigiúin seo go roghnach ar shuíomhanna imeachta sonracha ER (ERES), áit ar féidir ceirimíd agus GPI-AP bunaithe ar cheirimíd a chomhiompar chuig an Golgi sa veicil COPII tiomnaithe céanna (5).
Sa staidéar seo, rinneamar tástáil dhíreach ar an meicníocht seo atá bunaithe ar lipidí trí úsáid a bhaint as micreascópacht íomháithe fíor-ama chomhfhócasach sár-réitigh (SCLIM), ar teicníc mhicreascópachta ceannródaíoch í ar féidir léi próitéiní lipéadaithe go fluaraiseach a bhreathnú ag an am céanna. Tá réiteach agus luas thar a bheith ard ag na híomhánna trí-dhath agus tríthoiseach (3T) i gcealla beo (21, 22).
Ar dtús, chuireamar teicneolaíocht SCLIM i bhfeidhm chun tuilleadh sainithe a thabhairt ar an gcaoi a ndearnadh scagadh ar GPI-AP gnáth le grúpa ceramide C26 ó phróitéiní rúnda trasmembrane tar éis dóibh an ER a fhágáil i S. cerevisiae. Chun aicmiú ER a sheiceáil, d'úsáideamar córas géiniteach ar féidir leis lasta nua-shintéisithe ag dul isteach i ERES a shamhlú go díreach in vivo (7, 23). Mar lasta, roghnaíomar GPI-AP Gas1 bunaithe ar ceramide C26 lipéadaithe le próitéin fluaraiseach glas (GFP) agus próitéin rúnda trasmembrane Mid2 lipéadaithe le próitéin fluaraiseach gar-infridhearg (iRFP), agus díríonn an dá cheann acu ar an membrane plasma (24–26). Sa mhútant íogair teochta sec31-1, léirítear an dá lasta seo faoi phromotóir in-ionduchtaithe galactose agus marcóir ERES bunreachtúil. Ag an teocht mhór (37°C), toisc go mbíonn tionchar ag an mhútant sec31-1 ar fheidhm chomhpháirt chóta COPII Sec31 chun péacadh COPII agus onnmhairiú ER a chosc, carnann lasta nua-shintéisithe ag an ER (23). Tar éis fuaraithe go teocht íseal (24°C), tháinig na cealla sóchánacha sec31-1 chucu féin ón limistéar rúnda, agus thosaigh an lasta sintéiseach nua carntha á onnmhairiú ón ER. Léirigh léirshamhlú CLIM go raibh an chuid is mó den Gas1-GFP agus Mid2-iRFP nua-shintéisithe fós carntha in ER na gcealla sóchánacha sec31-1 tar éis goradáin ag 37°C agus ansin scaoilte ag 24°C ar feadh 5 nóiméad (Fíor 1). Ós rud é go bhfuil Mid2-iRFP dáilte ar an membrane ER iomlán, agus go bhfuil Gas1-GFP comhchruinnithe agus bailithe i limistéar membrane neamhleanúnach an ER, tá a ndáileadh go hiomlán difriúil (Fíor 1, A go C agus Scannán S1). Ina theannta sin, mar a thaispeántar i bhFíor 1D, níl Mid2-iRFP ag an mbraisle Gas1-GFP. Léiríonn na torthaí seo gur scaradh próitéiní GPI-AP agus trasmembrane ina réigiúin éagsúla membrane ER go luath. Tá an braisle Gas1-GFP cóngarach do ERES ar leith atá lipéadaithe le próitéin chóta COPII mCherry Sec13 (Fíor 1, E agus F, agus scannán S1) (23).
Léiríonn cealla sec31-1 rúin spreagtha ag galactós, ceirimíd slabhra fada acile (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, glas) agus an próitéin trasmembrane Mid2-iRFP (TMP, gorm) agus goradh an lipéadú ERES Tógálach seo Sec13-mCherry (ERES, magenta) ag 37°C ar feadh 30 nóiméad, bogadh go 24°C é, agus rinneadh íomháú de le SCLIM 5 nóiméad ina dhiaidh sin. Taispeánann (A go C) íomhá chumasctha nó aonair 2T d'eitleán (A), íomhá teilgean 2T de 10 z-alt (B) nó íomhá leathsféir cille 3T de lasta agus marcóirí ERES (C). Barra scála 1μm (A agus B). Is é 0.551μm an t-aonad scála (C). Braitheadh ​​Gas1-GFP i réigiúin nó i mbraislí scoite ER, agus braitheadh ​​agus dáileadh Mid2-iRFP ar fud membrane an ER (C). (D) Taispeánann an graf déine fluaraiseachta coibhneasta Gas1-GFP agus Mid2-iRFP sa bhraisle Gas1-GFP feadh na líne saighead bán (ar chlé). AU, aonad treallach. Léiríonn (E agus F) an íomhá 3T a chomhcheanglaíonn na hearraí agus marc ERES. Braitheadh ​​​​braislí Gas1-GFP in aice leis an ERES sonrach. Is é 0.551μm an t-aonad scála. (F) Marcálann an tsaighead sholadach bán an braisle Gas1-GFP a bhaineann le ERES. Taispeánann na painéil lár agus ar dheis an íomhá 3T méadaithe cumasctha agus radharc rothlaithe den bhraisle Gas1-GFP roghnaithe.
Léiríonn an gaol spásúil dlúth idir an braisle Gas1-GFP agus ERES ar leith gur féidir le Gas1-GFP dul isteach in ERES roghnach, rud atá difriúil ón roghnaíocht a úsáideann Mid2-iRFP chun an ER a fhágáil. Chun aghaidh a thabhairt ar an bhféidearthacht seo, rinneamar cainníochtú ar an gcóimheas ERES d'earra amháin nó dhó (Fíor 2, A go C). Fuaireamar amach nach bhfuil ach cineál amháin lasta i bhformhór na n-ERES (70%). Taispeánann íomhá bun Fíor 2C dhá shampla tipiciúla de ERES le Gas1-GFP amháin (Fíor 1) nó Mid2-iRFP amháin (Fíor 2). I gcodarsnacht leis sin, tá dhá lasta a fhorluíonn sa limistéar céanna i thart ar 20% de ERES. Fuarthas amach go raibh dhá chineál lasta i roinnt ERES (10%), ach bhí siad scartha amach i limistéir atá soiléir difriúil. Dá bhrí sin, léiríonn an anailís staitistiúil seo, tar éis an ER a onnmhairiú, go bhfuil GPI-AP Gas1-GFP agus an lasta trasmembrane Mid2-iRFP roinnte ina ERESanna éagsúla (Fíor 2D). Tá an éifeachtúlacht sórtála seo an-chomhsheasmhach leis an anailís bithcheimiceach (6) agus an cinneadh moirfeolaíoch (7) roimhe seo. Is féidir linn iompar an lasta coraintín atá ag dul isteach in ERES a fheiceáil freisin (Fíor 2E agus Scannán S2). Léiríonn Fíor 2E nach dtéann ach cuid bheag de Gas1-GFP (painéal 3) nó Mid2-iRFP (painéal 4) isteach san ERES ó thaobh amháin agus go bhfuil sé teoranta i limistéar ar leith. Léiríonn Painéal 5 de Fhíor 2E go bhfaightear Gas1-GFP agus Mid2-iRFP uaireanta san ERES céanna, ach go dtéann siad isteach ó thaobhanna difriúla agus go bhfuil siad comhchruinnithe i réigiúin ar leithligh a d'fhéadfadh veicilí COPII éagsúla a léiriú. Dheimhnigh muid freisin go bhfuil an scaradh agus an t-aicmiú a breathnaíodh ar GPI-AP Gas1 bunaithe ar cheirmíd C26 mar ERES roghnach sonrach toisc go bhfuil lasta secretion trasmembrane eile, an próitéin plasma membrane clib-GFP Axl2 (27), ag taispeáint iompar cosúil le Mid2-iRFP. (Pictiúr S1 agus Scannán S3). Déantar an Axl2-GFP nua-shintéisithe a dháileadh tríd an membrane ER cosúil le Mid2-iRFP (Fíor S1, A agus B), agus tá sé comh-lonnaithe le Mid2-iRFP i bhformhór na ERES (Fíor S1, B go D). Taispeánann Painéil 1 agus 2 de Fhíor 1. S1C dhá shampla tipiciúla de ERES ina bhfuil dhá lasta trasmembrane ag forluí. Sna cásanna seo, téann an dá earra isteach in ERES le chéile (Fíor S1E, Painéal 3 agus Scannán S3).
Cuireadh na cealla sec31-1 a léiríonn rúin ionduchtaithe galachtóis, Gas1-GFP (GPI-AP, glas) agus Mid2-iRFP (TMP, gorm) agus lipéadú bunreachtúil ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) ag 37. Tar éis goradh ar feadh 30 nóiméad ag °C, bog go 24 °C chun an bloc rúin a scaoileadh, agus íomháú le SCLIM tar éis 20 nóiméad. (A go C) Íomhánna teilgean ionadaíocha 2T (A; barra scála, 1μm) nó íomhánna leathsféir cealla 3T (B agus C; aonad scála, 0.456μm) den lasta agus 10 z-alt marcáilte le ERES. Taispeánann an painéal íochtarach i (B) agus an painéal i (C) íomhánna próiseáilte chun na hearraí atá i láthair in ERES (magenta) amháin [Gas1-GFP (liath) agus Mid2-iRFP (gorm éadrom)] a thaispeáint. (C) Saighead oscailte: Ní iompraíonn ERES ach píosa amháin lasta (1 go 4). Saighead liath: Tá lasta scartha san ERES (5). Saighead bán sholadach: Tá lasta comhlonnaithe san ERES. Thíos: Níl ach Gas1-GFP (1) nó Mid2-iRFP (2) san ERES aonair roghnaithe. Barra scála, 100 nm. (D) Cainníochtú an mhicreagraf fótagrafach a thuairiscítear i (C). An céatadán meánach de ERES ina bhfuil lasta amháin (Gas1-GFP nó Mid2-iRFP), lasta scartha agus lasta forluiteach. I dtrí thurgnamh neamhspleácha, n=432 i 54 cealla. Barra earráide = SD. Tástáil t neamhphéireáilte dhá thaobh. *** P = 0.0002. (E) Íomhá 3D de ERES roghnaithe de lasta coraintín marcáilte le (C). Téann Gas1-GFP (glas) (3) nó Mid2-iRFP (gorm) (4) isteach san ERES (maigeanta) ó thaobh amháin agus tá sé srianta do limistéar beag laistigh den ERES. Uaireanta, téann an dá chineál lasta isteach san ERES céanna (5) ón taobh céanna agus tá siad srianta do limistéar scoite laistigh den ERES. Barra scála, 100 nm.
Ansin, rinneamar tástáil ar hipitéis go dtiomáineann an ceirimíd slabhra fada acile (C26) atá i láthair i scannán an ER an braisliú agus an sórtáil shonrach de Gas1 i ERES roghnach. Chun na críche seo, d'úsáideamar stráin giosta modhnaithe GhLag1, ina ndearnadh an dá shintéis ceirimíde intíre Lag1 agus Lac1 a athsholáthar le GhLag1 (homalóg Lag1 de chadás), rud a eascraíonn i stráin giosta le stráin Ceirimíde membrane cille níos giorra ná an cineál fiáin (Fíor 3A) (28). Léirigh anailís mais-speictriméadrachta (MS) i stráin chineál fiáin, gur ceirimíd slabhra an-fhada (C26) é 95% den ceirimíd iomlán, agus i GhLag1, gur ceirimíd slabhra an-fhada (C18 agus C16) é 85% den ceirimíd an-fhada (C18 agus C16). , níl ach 2% den ceirimíd ina ceirimíd slabhra an-fhada (C26). Cé gurb iad ceramides C18 agus C16 na príomh-cheramides a braitheadh ​​i scannán GhLag1 go dtí seo, dheimhnigh anailís MS freisin go bhfuil ceramide C26 in ancaire GPI Gas1-GFP atá léirithe sa strain GhLag1, atá inchomparáide le lipidí cineál fiáin. Tá an caighdeán mar a chéile (Fíor 3A) (26). Dá bhrí sin, ciallaíonn sé seo go bhfuil an einsím athmhúnlaithe ceramide Cwh43 an-roghnach do ceramide C26, mar a thaispeántar i bhFíor 26, ionchorpraíonn sé go roghnach ancaire GPI ó mhéid beag de ceramide C26 sa strain GhLag1. S2 (29). Mar sin féin, níl ach ceramide C18-C16 i scannán cille GhLag1 go bunúsach, agus tá ceramide C26 fós i Gas1-GFP. Fágann an fhíric seo gur uirlis idéalach é an strain seo chun fadhb fhad slabhra acyl ceramide membrane san ER a réiteach go sonrach. Ról hipitéiseach an ranga agus an sórtála. Ansin, rinneamar staidéar ar dtús ar chumas C26 Gas1-GFP carnadh i mbraislí i GhLag1 le hailéil sóchán íogair teochta de sec31-1 trí mhicreascópacht fhluaraiseachta traidisiúnta, áit nach bhfuil ach an slabhra fada (C18-C16) i membrane ER Ceramide (Fíor 3). Thugamar faoi deara i sec31-1, go raibh an chuid is mó de Gas1-GFP comhchruinnithe i mbraislí, agus nach raibh Gas1-GFP i sec31-1 GhLag1 le membrane ER ceramide fada (C18-C16) braislithe agus dáilte den chuid is mó i membrane ER iomlán. Le bheith beacht, toisc go bhfuil braisliú bunaithe ar ceramide C26 dlúthbhainteach le ERES sonrach (Fíor 1), rinneamar imscrúdú ina dhiaidh sin an bhféadfadh feidhm mheicníocht próitéine onnmhairithe ER a bheith i gceist leis an bpróiseas seo freisin. Úsáideann GPI-AP córas COPII speisialta le haghaidh onnmhairithe ER, atá rialaithe go gníomhach ag athmhúnlú struchtúrach Ted1 ar chuid glycan ancaire GPI (30, 31). Ansin, aithníonn an coimpléasc gabhdóra lasta trasmembrane p24 an GPI-glycan athchuingreach, a earcaíonn Lst1 go roghnach ina dhiaidh sin, arb é isoform sonrach é den phríomhfho-aonad ceangailteach lasta COPII Sec24, ag foirmiú COPII saibhir i GPI-AP. Tá gá le veicilí (31-33). Dá bhrí sin, thógamar sóchán dúbailte a chomhcheangail scriosadh na bpróitéiní aonair seo (an chomhpháirt choimpléasc p24 Emp24, einsím athmhúnlaithe GPI-glycan Ted1 agus an fho-aonad sonrach COPII Lst1) leis an strain sóchán sec31-1, agus rinneamar staidéar orthu. An féidir GFP braisle Gas1 a fhoirmiú (Fíor 3). Thugamar faoi deara i sec31-1emp24Δ agus sec31-1ted1Δ, go bhfuil Gas1-GFP neamhbhraislithe den chuid is mó agus dáilte ar fud membrane an ER, mar a chonacthas roimhe seo i sec31-1 GhLag1, agus i sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Cosúil le sec31-1. Léiríonn na torthaí seo, chomh maith le láithreacht ceramide C26 i scannán an ER, go gcaithfidh braisliú Gas1-GFP ceangal leis an gcoimpléasc p24 freisin, agus nach dteastaíonn earcaíocht shonrach Lst1 uaidh. Ansin, rinneamar iniúchadh ar an bhféidearthacht gur féidir le fad slabhra ceramide i scannán an ER ceangal Gas1-GFP le p24 a rialáil. Mar sin féin, fuarthas amach nach mbíonn tionchar ag láithreacht ceramide C18-C16 sa scannán ar na GPI-glicáin atá atógtha ag an gcoimpléasc p24 (Fíoracha S3 agus S4, A agus B) ná ar an gceangail le GPI-AP agus ar chumas easpórtála GPI-AP. Earcaigh fochineál COPII Lst1 (Fíor S4C). Dá bhrí sin, ní gá idirghníomhaíochtaí próitéine le meicníochtaí easpórtála próitéine ER éagsúla a bheith ag braisliú atá ag brath ar ceramide C26, ach tacaíonn sé le meicníocht sórtála malartach atá á tiomáint ag fad lipid. Ansin, rinneamar anailís ar cibé an bhfuil fad slabhra acyl ceramide i scannán an ER tábhachtach chun Gas1-GFP a aicmiú go héifeachtach mar ERES roghnach. Ós rud é go bhfágann Gas1 sa strain GhLag1 le ceirimíd ghearrshlabhra an ER agus go dtéann sé isteach sa membrane plasma (Fíor S5), creidimid má thiomáineann fad an tslabhra ceirimíde acile an sórtáil, gur féidir an Gas1 sa strain GhLag1 a atreorú agus a thrasnú. Earraí ERES leis an membrane céanna.
(A) Is i scannán cille GhLag1 den chuid is mó atá ceirimídí C18-C16 níos giorra, agus tá an C26 IPC céanna ag ancaire GPI Gas1-GFP agus atá ag cealla cineál fiáin. Thuas: anailís ar fhad slabhra acile ar cheirimíd i scannán cille na sraitheanna cineál fiáin (Wt) agus GhLag1p trí mhais-speictriméadracht (MS). Léiríonn na sonraí céatadán na ceirimíde iomláin. Meán trí thurgnamh neamhspleácha. Barra earráide = SD. Tástáil t neamhphéireáilte dhá thaobh. **** P <0.0001. Painéal bun: Anailís MS ar fhad slabhra acile an IPC atá i láthair san ancaire GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) a léirítear sna sraitheanna cineál fiáin agus GhLag1p. Léiríonn na sonraí céatadán an chomhartha IPC iomláin. Meán cúig thurgnamh neamhspleácha. Barra earráide = SD. Tástáil t neamhphéireáilte dhá thaobh. ns, gan tábhacht. P = 0.9134. (B) Rinneadh micreagraif fluaraiseachta de chealla sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ agus sec31-1lst1Δ a léirigh Gas1-GFP spreagtha ag galachtós a ghoradh ag 37°C ar feadh 30 nóiméad agus cuireadh síos iad chuig Déan micreascópacht fluaraiseachta rialta tar éis 24°C. Saighead bhán: Braisle ER Gas1-GFP. Saighead oscailte: Tá Gas1-GFP neamhbhraislithe dáilte ar an membrane ER ar fad, ag taispeáint an ruaimniú fáinne núicléach tréith ER. Barra scála, 5μm. (C) Cainníochtú an mhicreagraif fótagrafa a thuairiscítear i (B). Meánchéatadán na gcealla le struchtúr poncúil Gas1-GFP. I dtrí thurgnamh neamhspleácha, n≥300 cealla. Barra earráide = SD. Tástáil t neamhphéireáilte dhá-eireaballach. **** P <0.0001.
Chun an fhadhb seo a réiteach go díreach, rinneamar léirshamhlú SCLIM ar Gas1-GFP agus Mid2-iRFP i GhLag1 leis an ailéil mhútach íogair teochta sec31-1 (Fíor 4 agus Scannán S4). Tar éis an ER a choinneáil ag 37°C agus a scaoileadh ina dhiaidh sin ag 24°C, níor braislíodh agus níor dáileadh an chuid is mó den Gas1-GFP nua-shintéisithe ar fud membrane an ER, mar a breathnaíodh le micreascóip thraidisiúnta (Fíor 4, A agus B). Ina theannta sin, áirítear le céatadán mór de ERES (67%) dhá chineál lasta atá suite ann (Fíor 4D). Taispeánann Painéil 1 agus 2 de Fhíor 4C dhá shampla tipiciúla de ERES le Gas1-GFP agus Mid2-GFP forluiteacha. Ina theannta sin, earcaíodh an dá earra isteach san ERES céanna (Fíor 4E, painéal 3 agus scannán S4). Dá bhrí sin, léiríonn ár dtorthaí gur cinntitheach tábhachtach é fad an tslabhra ceirimíde acile i membrane an ER maidir le comhiomlánú agus aicmiú próitéine ER.
Cealla Sec31-1 GhLag1 a léiríonn rúin spreagtha ag galachtós, Gas1-GFP (GPI-AP, glas) agus Mid2-iRFP (TMP, gorm) agus Sec13-mCherry lipéadaithe le ERES comhréireach (ERES, maigeanta). Gor ag 37°C. Lean ar aghaidh ar feadh 30 nóiméad, ísligh go 24°C chun rúin a scaoileadh, agus íomháigh le SCLIM tar éis 20 nóiméad. (A go C) Íomhánna teilgean ionadaíocha 2T (A; barra scála, 1μm) nó íomhánna leathsféir cille 3T (B agus C; aonad scála, 0.45μm) de na 10 z-alt atá marcáilte le lasta agus ERES. Taispeánann an painéal íochtarach i (B) agus an painéal i (C) íomhánna próiseáilte chun na hearraí atá i láthair in ERES (maigeanta) amháin a thaispeáint [Gas1-GFP (liath) agus Mid2-iRFP (gorm éadrom)]. (C) Saighead líonta bán: ERES, forluí earraí. Saighead oscailte: Níl ach mír amháin in ERES. Painéal íochtarach: Tá earraí forluiteacha (1 agus 2) marcáilte i (C) ag an ERES roghnaithe. Barra scála, 100 nm. (D) Cainníochtú an mhicreagraf fótagrafach a thuairiscítear i (C). Sna haonaid GhLag1 sec31-1 agus sec31-1, níl ach lasta amháin (Gas1-GFP nó Mid2-iRFP) san áireamh, agus an céatadán meánach de ERES le haghaidh lasta scoite agus lasta forluiteach. I dtrí thurgnamh neamhspleácha, n = 432 i 54 cealla (sec31-1) agus n = 430 i 47 cealla (sec31-1 GhLag1). Barra earráide = SD. Tástáil t neamhphéireáilte dhá thaobh. *** P = 0.0002 (sec31-1) agus ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Íomhá 3T den ERES roghnaithe le lasta forluiteach (3) marcáilte i (C). Tagann Gas1-GFP (glas) agus Mid2-iRFP (gorm) i dtreo ERES (magenta) ón taobh céanna agus fanann siad sa limistéar srianta ERES céanna. Barra scála, 100 nm.
Soláthraíonn an staidéar seo fianaise dhíreach in vivo go ndéantar lastais próitéine bunaithe ar lipidí a aicmiú i suíomhanna onnmhairithe roghnacha sa chonair rúnda, agus nochtar tábhacht fhad slabhra acile maidir le roghnaíocht aicmithe. Ag baint úsáide as teicníc micreascópachta chumhachtach agus ceannródaíoch ar a dtugtar SCLIM, léiríomar an Gas1-GFP nua-shintéisithe (GPI-AP mór membrane plasma le cuid lipid ceramide slabhra acile (C26) an-fhada) i giosta). Tá na réigiúin atá braislithe i ERanna scoite bainteach le ERES sonrach, agus tá próitéiní secreted trasmembrane dáilte ar fud membrane an ER (Fíor 1). Ina theannta sin, téann an dá chineál earraí seo isteach i ERESanna éagsúla go roghnach (Fíor 2). Laghdaítear fad slabhra acile an cheramide ceallaigh sa membrane ó C26 go C18-C16, cuirtear isteach ar an mbraisle Gas1-GFP isteach sa réigiún ER scoite, agus atreoraítear Gas1-GFP chun an ER a fhágáil leis an bpróitéin trasmembrane tríd an ERES céanna (Fíor 3 agus Fíor 3). 4).
Cé go n-úsáideann GPI-AP meicníocht próitéine speisialaithe chun imeacht as an ER, fuarthas amach nach mbraitheann scaradh atá ag brath ar cheirimide C26 ar idirghníomhaíochtaí próitéine difreálacha a d'fhéadfadh speisialtóireacht ERES a bheith mar thoradh orthu (Fíoracha S4 agus S5). Ina áit sin, tacaíonn ár dtorthaí le meicníocht aicmithe malartach atá á tiomáint ag braisliú próitéine bunaithe ar lipidí agus eisiamh lasta eile ina dhiaidh sin. Léiríonn ár mbreathnuithe nach bhfuil an próitéin rúnda trasmembrane Mid2-iRFP ag an réigiún nó sa bhraisle Gas1-GFP a bhaineann le ERES ar leith, rud a léiríonn go n-éascóidh an braisle GPI-AP atá ag brath ar cheirimide C26 a n-iontráil isteach san ERES ábhartha, agus ag an am céanna, go n-eisiafaidh sé trasmembrane. Téann na rúnduithe isteach san ERES seo (Fíoracha 1 agus 2). I gcodarsnacht leis sin, ní chuireann láithreacht cheirimidí C18-C16 i scannán an ER faoi deara go bhfoirmíonn GPI-AP réigiúin ná braislí, mar sin ní eisiann siad ná ní athsholáthraíonn siad próitéiní rúnda trasmembrane isteach san ERES céanna (Fíoracha 3 agus 4). Dá bhrí sin, molaimid go spreagann ceirimíd C26 scaradh agus aicmiú trí chnuasach próitéiní atá nasctha le ERESanna sonracha a éascú.
Conas an braisliú seo atá ag brath ar cheiriméid C26 a bhaint amach i limistéar ER ar leith? Féadfaidh claonadh cheiriméid an scannáin scaradh go cliathánach a chur faoi deara go bhfoirmíonn GPI-AP agus ceiriméid C26 lipidí beaga agus ordaithe láithreach i dtimpeallacht lipid níos neamhrialta an scannáin ER ina bhfuil gliocróilipidí níos giorra agus níos neamhsháithithe. Braislí ardchaighdeáin (17, 18). Is féidir na braislí beaga sealadacha seo a chumasc tuilleadh i mbraislí níos mó agus níos cobhsaí tar éis dóibh ceangal leis an gcoimpléasc p24 (34). Ag teacht leis seo, thaispeánamar go gcaithfidh C26 Gas1-GFP idirghníomhú leis an gcoimpléasc p24 chun braislí infheicthe níos mó a fhoirmiú (Fíor 3). Is oligiméir heitrisigeach é an coimpléasc p24 atá comhdhéanta de cheithre phróitéin trasmembrane p24 éagsúla i giosta (35), a sholáthraíonn ceangal ilfhiúsach, rud a d'fhéadfadh trasnascadh braislí beaga GPI-AP a bheith mar thoradh air, rud a ghineann braisle Cobhsaí níos mó (34). D’fhéadfadh an t-idirghníomhú idir eictodheiminí próitéine GPI-APanna cur lena gcomhiomlánú freisin, mar a léirítear le linn a n-iompair Golgi i gcealla eipitéiliacha polaraithe mamaigh (36). Mar sin féin, nuair a bhíonn ceirimíd C18-C16 i láthair sa membrane ER, nuair a cheanglaíonn an coimpléasc p24 le Gas1-GFP, ní chruthófar braislí móra ar leithligh. D’fhéadfadh an mheicníocht bhunúsach a bheith ag brath ar airíonna fisiceacha agus ceimiceacha sonracha an ceirimíd slabhra fada acile. Léiríonn staidéir bhithfhisiceacha ar scannáin shaorga, cé gur féidir le ceirimídí slabhra fada acile (C24) agus gearra (C18-C16) scaradh céime a chur faoi deara, nach féidir ach le ceirimídí slabhra fada acile (C24) cuar ard agus lúbadh scannáin a chur chun cinn chun an scannán a athmhúnlú. Trí thagairt fhrithpháirteach (17, 37, 38). Tá sé léirithe go n-idirghníomhaíonn héilics trasmembrane TMED2, homalóg dhaonna Emp24, go roghnach le sfingoimíléin bunaithe ar cheirmíd C18 sna lóibíní cíteaplasmacha (39). Ag baint úsáide as insamhaltaí dinimice móilíneacha (MD), fuarthas amach go mbailíonn ceirmídí C18 agus C26 araon timpeall ar na lóibíní cíteaplasmacha den héilics trasmembrane Emp24, agus go bhfuil roghanna comhchosúla acu (Fíor S6). Is fiú a thabhairt faoi deara go léiríonn sé seo gur féidir le héilics trasmembrane Emp24 dáileadh neamhshiméadrach lipidí sa membrane a bheith mar thoradh air. Is toradh le déanaí é seo bunaithe ar chealla mamaigh. Taispeánann insamhaltaí MD comhchosúla láithreacht lipidí éitear freisin (40). Dá bhrí sin, táimid ag tuairimíocht go bhfuil ceirmíd C26 sna dhá lóibín de ER26 saibhrithe go háitiúil. Nuair a cheanglaíonn GPI-AP sna lóibíní lumineacha go díreach le p24 ilfhiúsach agus carnadh ceramide C26 timpeall p24 sna lóibíní cíteaplasmacha, is féidir leis an gcomhiomlánú próitéine agus cuaradh membrane a chur chun cinn trí na méara (41), rud a fhágann go scarann ​​GPI-AP ina réigiúin ar leithligh in aice le ERES, rud a fhabhraíonn réigiúin an-chuartha membrane ER freisin (42). Thacaigh tuarascálacha roimhe seo leis an sásra atá beartaithe (43, 44). Spreagann ceangal ilfhiúsach oligoleictiní, pataiginí nó antasubstaintí le gliocasfingolipidi bunaithe ar cheramide (GSL) ar an membrane plasma comhiomlánú mór GSL, feabhsaíonn sé scaradh céime agus is cúis le dífhoirmiú agus inmheánú membrane (44). Iwabuchi etc. (43) Fuarthas amach, i láthair slabhraí fada acile (C24) ach ní gearra (C16), gur spreag an ligand ilfhiúsach atá ceangailte le lachtasilcéaramíd GSL foirmiú braislí móra agus ionghabháil membrane, agus go bhfuil trasduchtú comhartha idirghabhála Lyn sa chíteaplasma ar na bileoga idirnasctha ag slabhraí acile i neodróifilí cúpláilte.
I gcealla eipitéiliacha polaraithe mamaigh, rialaíonn tiúchan an líonra frith-Golgi (TGN) go dtí leibhéal an scannáin plasma apical scaradh agus sórtáil GPI-AP (10, 45). Tiomáintear an comhiomlánú seo ag oligiméiriú GPI-AP (36), ach d'fhéadfadh sé a bheith ag brath freisin ar fhad an tslabhra ceirimíde a fhaighimid i giosta. Cé go bhfuil ancaire bunaithe ar lipid éitear ag GPI-AP mamaigh, agus go bhfuil a struchtúr ceimiceach an-difriúil ón gceirimíd slabhra acile an-fhada, fuarthas i staidéar le déanaí go bhfuil airíonna fisiceacha agus ceimiceacha agus feidhm chomhchosúil ó thaobh na héabhlóide de ag an dá lipid (40). Dá bhrí sin, d'fhéadfadh an chuid lipid éitear i gcealla mamaigh a bheith cosúil leis an gceirimíd C26 i giosta, agus is é a ról ná comhlachas a dhéanamh leis an gceirimíd slabhra fada sa scannán chun comhiomlánú agus sórtáil GPI-AP a chur chun cinn. Cé go gcaithfear an fhéidearthacht seo a thástáil go díreach fós, tacaíonn torthaí roimhe seo leis an bhfíric nach ndéantar iompar an cheirimíde slabhra acile fada chuig corp Golgi ag próitéiní aistrithe cíteaplasmacha, ach go mbraitheann sé ar shintéis ancairí GPI cosúil le giosta. Dá bhrí sin, is cosúil go bhfuil an mheicníocht choimeádach éabhlóideach in ann ceirimíd slabhra acile an-fhada agus GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) a chomhiompar go roghnach sa veicil iompair chéanna.
I gcórais chealla eipitéiliacha polaraithe giosta agus mamaigh, tarlaíonn comhiomlánú agus scaradh GPI-AP ó phróitéiní membrane plasma eile sula sroicheann siad dromchla na cille. Fuair ​​Paladino et al. (48) amach, ar TGN na gcealla eipitéiliacha polaraithe mamaigh, nach bhfuil braisliú GPI-AP riachtanach amháin chun GPI-APanna a aicmiú go roghnach chuig an membrane plasma apical, ach go rialaíonn sé eagrú braislithe GPI-APanna agus a ghníomhaíocht bhitheolaíoch freisin. Dromchla na cille. I giosta, léirigh an staidéar seo gur féidir leis an mbraisle GPI-AP atá ag brath ar cheiriméid C26 ar an ER eagrú braisle agus gníomhaíocht fheidhmiúil GPI-AP ar an membrane plasma a rialáil (24, 49). Ag teacht leis an tsamhail seo, tá cealla GhLag1 ailléirgeach le coscairí GPI nó le drugaí a théann i bhfeidhm ar shláine bhalla na cille (28), agus léiríonn an gá atá le braislí feidhmiúla Gas1-GFP (49) den cheiriméid barr a teilgtear i bpáipéalú cealla giosta G​​​ Iarmhairtí fiseolaíocha féideartha cealla hLag1. Earráid GPI-AP. Mar sin féin, beidh tuilleadh tástálacha ann chun a fháil amach an ndearnadh eagrú feidhmiúil dhromchla na cille a chlárú ón ER trí mhodh sórtála bunaithe ar fhad lipidí.
Tá na cineálacha Saccharomyces cerevisiae a úsáideadh sa saothar seo liostaithe i dTábla S1. Tógadh na cineálacha MMY1583 agus MMY1635 de SCLIM le haghaidh íomháú cealla beo i gcúlra W303. Tógadh na cineálacha seo a léiríonn Sec13-mCherry le clib próitéine fluaraiseach ag baint úsáide as modh bunaithe ar imoibriú slabhrúil polaiméaráise (PCR) le plaismíd pFA6a mar theimpléad (23). Tógadh an cineál a léiríonn Mid2-iRFP lipéadaithe le próitéin fluaraiseach faoi rialú an phromótóra GAL1 mar seo a leanas. Aimpliú PCR ar sheicheamh iRFP-KanMx ó veicteoir pKTiRFP-KAN (bronntanas ó E. O'Shea, uimhir phlasimíde Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; aitheantóir acmhainne taighde (RRID): Addgene_64687) Agus curtha isteach i gcríoch-C Mid2 inchríneacha. Tar éis don seicheamh géanóim Mid2-iRFP a bheith aimplithe agus clónáilte isteach sa phromotóir GAL1, rinneadh é a chomhtháthú i suíomh Not I-Sac I an phlasmaid chomhtháthaithe pRS306. Rinneadh an plaismíd pRGS7 a lean as sin a líneáil le Pst I chun é a chomhtháthú isteach sa lócas URA3.
Déantar an géin chomhleá Gas1-GFP a chur in iúl faoi rialú an phromotóra GAL1 sa phlasmaid ceintréiméir (CEN), atá tógtha mar seo a leanas. Rinneadh an seicheamh Gas1-GFP a aimpliú trí PCR ón phlasmaid pRS416-GAS1-GFP (24) (bronntanas ó L. Popolo) agus clónáladh é isteach i suíomh Xma I–Xho I an phlasmaid CEN pBEVY-GL LEU2 (bronntanas ó C). Miller; Uimhir phlasmaid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Tugadh pRGS6 ar an phlasmaid mar thoradh air sin. Déantar an géin chomhleá Axl2-GFP a chur in iúl freisin faoi rialú phromotóra GAL1 an veicteora pBEVY-GL LEU2, agus is mar seo a leanas a thógáil. Rinneadh an seicheamh Axl2-GFP a aimpliú ó phlasmaid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) trí PCR, agus clónáladh é isteach i suíomh Bam HI-Pst I de veicteoir pBEVY-GL LEU2. Tugadh pRGS12 ar an bplasmaid a lean as. Tá seicheamh na n-oliganúicléatídí a úsáideadh sa staidéar seo liostaithe i dTábla S2.
Cuireadh 0.2% adenín agus 2% glúcós [YP-deasglúcós (YPD)], meán próitéine p (YP) saibhir i reifinóis [YP-reifinóis] (1% sliocht giosta agus 2% próitéin ept). (YPR)] nó 2% galachtós [YP-galachtós (YPG)] leis an strain mar fhoinse carbóin, nó i meán íosta sintéiseach (0.15% bonn nítrigine giosta agus 0.5% sulfáit amóiniam) chun na haigéid agus na bunanna cuí a theastaíonn le haghaidh cothaithe a fhorlíonadh, agus ina raibh 2% glúcós (meán íosta glúcóis sintéiseach) nó 2% galachtós (meán íosta galachtós sintéiseach) mar fhoinse carbóin.
Chun íomháú fíor-ama a dhéanamh, fásadh cealla sóchánacha sec31-1 íogaire ó thaobh teochta de a raibh an tógáil á léiriú acu faoin bpromotóir GAL1 i meán YPR ag 24°C thar oíche go dtí céim lár-log. Tar éis ionduchtaithe i YPG ag 24°C ar feadh 1 uair an chloig, goradh na cealla in SG ag 37°C ar feadh 30 nóiméad, agus ansin aistríodh go 24°C iad le scaoileadh ón mbloc secretion. Baineadh úsáid as Concanavalin A chun na cealla a shocrú ar shleamhnán gloine agus rinneadh íomháú díobh le SCLIM. Is meascán é SCLIM de mhicreascóp fluaraiseachta inbhéartaithe Olympus IX-71 agus lionsa ola cró uimhriúil UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), scanóir comhfhócasach diosca rothlach ardluais agus cóimheas comhartha-go-torann ard (Yokogawa Electric), speictriméadar saincheaptha, agus fuarú saincheaptha. Is féidir le dianaitheoir íomhá an chórais (Hamamatsu Photonics) córas lionsa formhéadúcháin a sholáthar le formhéadú deiridh ×266.7 agus ceamara gléas luchtaithe-cúpláilte a iolraíonn leictreoin (Hamamatsu Photonics) (21). Déantar fáil íomhá le bogearraí saincheaptha (Yokogawa Electric). I gcás íomhánna 3T, d'úsáideamar gníomhaitheoir piezoelectric saincheaptha chun an lionsa cuspóireach a chreathadh go hingearach, agus bhailíomar na codanna optúla 100 nm óna chéile i stac. Déantar íomhá an stac Z a thiontú ina sonraí voxel 3T, agus úsáidtear an fheidhm scaipthe pointe teoiriciúil a úsáidtear don mhicreascóp comhfhócasach diosca rothlach le haghaidh próiseála díchonbhlóide le bogearraí Volocity (PerkinElmer). Trí úsáid a bhaint as bogearraí Volocity chun tairseach uathoibríoch a shocrú le haghaidh anailíse comhlonnaíochta, tomhaiseadh ERES lena n-áirítear lasta. Rinneadh anailís scanadh líne ag baint úsáide as bogearraí MetaMorph (Molecular Devices).
Bain úsáid as bogearraí GraphPad Prism chun suntasacht staitistiúil a chinneadh. I gcás thástáil t déthaobhach an Mhic Léinn agus an ghnáththástáil anailíse aontreo ar athraitheas (ANOVA), meastar go mbíonn tionchar suntasach ag difríochtaí idir grúpaí ar P <0.05 (*).
I gcás micreascópacht fhluaraiseachta Gas1-GFP, fásadh na cealla céime log thar oíche in YPD agus bailíodh iad trí lártheifneoiriú, nite faoi dhó le saline maolaithe fosfáite, agus goradh iad ar oighear ar feadh 15 nóiméad ar a laghad, agus ansin leanadh orthu faoin micreascóp mar a thuairiscíodh roimhe seo Seiceáil (24). Baineadh úsáid as an micreascóp Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 ola PH3 CS) atá feistithe le lionsa oibiachtúil, scagaire L5 (GFP), ceamara Hamamatsu agus bogearraí Application Suite X (LAS X) le haghaidh fála.
Rinneadh na samplaí a dhínádúrú le maolán samplach SDS ag 65°C ar feadh 10 nóiméad, agus ansin scaradh iad trí leictreafóiréis glóthach polaicriolaimíde SDS (PAGE). Chun anailís imdhíonbhlotála a dhéanamh, luchtaíodh 10 μl den sampla in aghaidh an lána. Antashubstaint phríomhúil: Bain úsáid as frith-Gas1 pholachlónach coinín ag caolú 1:3000, frith-Emp24 pholachlónach coinín ag caolú 1:500, agus frith-GFP pholachlónach coinín (bronntanas ó H. Riezman) ag caolú 1:3000. Baineadh úsáid as antashubstaint mhonachlónach frith-Pgk1 luiche ag caolú 1:5000 (bronntanas ó J. de la Cruz). Antashubstaint thánaisteach: Imdhíonglobulin gabhair frith-choinín G (IgG) comhchuingeach le peirocsaídáis capaill (HRP) a úsáideadh ag caolú 1:3000 (Pierce). Baineadh úsáid as IgG gabhar frith-luch comhchuingithe le HRP ag caolú 1:3000 (Pierce). Breathnaíodh an crios freagartha imdhíonachta trí mhodh ceimiluminescence imoibrí SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Mar a thuairiscítear i (31), rinneadh turgnamh imdhíon-dheascadh nádúrtha ar an gcodán ER saibhrithe. Go hachomair, nigh cealla giosta le maolán TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluairíd feinilmeitilsulfónaile agus meascán coscaire próitéáis) ag 600 nm (OD600) ag dlús optúil 100 faoi dhó. Briseadh é le coirníní gloine, agus ansin baineadh an smionagar cille agus na coirníní gloine trí lártheifneoiriú. Ansin lártheifneoiríodh an forshnáithín ag 17,000 g ar feadh 15 nóiméad ag 4°C. Athfhionraíodh an millín in TNE agus cuireadh saponin digitalis leis go dtí tiúchan deiridh de 1%. Goradh an fionraí ar feadh 1 uair an chloig le rothlú ag 4°C, agus ansin baineadh na comhpháirteanna dothuaslagtha trí lártheifneoiriú ag 13,000 g ag 4°C ar feadh 60 nóiméad. Chun imdhíon-dheascadh Gas1-GFP a dhéanamh, réamh-ghoir an sampla ar dtús le coirníní agaróis folamh (ChromoTek) ag 4°C ar feadh 1 uair an chloig, agus ansin goir le GFP-Trap_A (ChromoTek) ag 4°C ar feadh 3 uair an chloig. Níodh na coirníní imdhíon-dheasctha cúig huaire le TNE ina raibh 0.2% digoxigenin, rinneadh iad a dhí-eluáil le maolán samplach SDS, scaradh iad ar SDS-PAGE, agus rinneadh anailís orthu trí imdhíon-bhlotáil.
Mar a thuairiscítear i (31), rinneadh cinneadh trasnasctha ar an gcodán ER saibhrithe. Go hachomair, rinneadh an codán ER saibhrithe a ghoradh le 0.5 mM déthiobis(succinimidil propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SAM; 20°C, 20 nóiméad). Múchadh an t-imoibriú trasnasctha trí ghlicín a chur leis (tiúchan deiridh 50 mM, 5 nóiméad, 20°C).
Mar a thuairiscíodh roimhe seo (50), rinneadh anailís MS ar cheirmíd i sraitheanna cineál fiáin agus GhLag1. Go hachomair, fásadh cealla go dtí céim easpónantúil (3 go 4 aonad OD600/ml) in YPD ag 30°C, agus bailíodh 25 × 107 cealla. Múchtar a meitibileacht le haigéad tríchlóraicéiteach. Bain úsáid as tuaslagóir eastósctha [eatánól, uisce, éitear, piridín agus hiodrocsaíd amóiniam 4.2 N (15:15:5:1:0.018 v/v)] agus 1.2 nmol de cheirmíd caighdeánach inmheánach C17 (cáilíocht 860517, lipid pholair Avanti)). Bain úsáid as imoibrí monaiméitilaimín [meatánól, uisce, tuaslagán n-bútanól agus meitiolaimín (4:3:1:5 v/v)] chun hidrealú alcaileach éadrom a dhéanamh ar an sliocht, agus ansin bain úsáid as n-bútanól sáithithe le huisce chun díshalannú. Ar deireadh, athfhionraíodh an sliocht i dtuaslagóir mód dearfach [clóraform/meatánól/uisce (2:7:1) + 5 mM aicéatáit amóiniam] agus instealladh isteach sa mais-speictriméadar é. Rinneadh monatóireacht il-imoibrithe (MRM) chun móilíní sfingolipid a aithint agus a chainníochtú. Tá foinse ian nana-shreabhadh róbatach Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) feistithe ar an mais-speictriméadar ceathairphoil treasach TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) le haghaidh anailíse lipid. Tá an fuinneamh imbhuailte optamaithe do gach catagóir ceirimíde. Fuarthas sonraí MS i mód dearfach. I gcás gach macasamhla bitheolaíoch, is é an comhartha lipid meán trí thomhas neamhspleácha.
Mar a thuairiscítear i (31), rinneadh imdhíon-dheascadh nádúrtha ar na cealla (800 × 107) a raibh Gas1-GFP á léiriú acu. Scaradh an Gas1-GFP íonaithe trí SDS-PAGE agus aistríodh é chuig scannán fluairíde polaiviniléine (PVDF). Rinneadh an próitéin a shamhlú trí PVDF a dhaiteadh le aimíd dubh. Gearradh an banda Gas1-GFP ón PVDF agus nite é 5 huaire le meatánól agus uair amháin le huisce grád crómatagrafaíochta leachta-MS (LC-MS). Trí an stiall scannáin a ghoradh le 500 μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), maolán agus 500 μl meascán nítrít sóidiam 1 M úr-thuaslagtha ag 37 °C ar feadh 3 uair an chloig, scaoiltear an codán lipid ó Gas1-GFP agus déantar é a scaoileadh Scaoileadh ceirimíd fosfáit inosine idir glúcósamín agus inositol (51). Ina dhiaidh sin, nite an stiall scannáin ceithre huaire le huisce grád LC-MS, triomaíodh í ag teocht an tseomra, agus stóráladh í in atmaisféar nítrigine ag -80 °C go dtí go ndéantar anailís uirthi. Mar rialú, úsáideadh sampla bán de scannán PVDF do gach turgnamh. Rinneadh anailís ansin ar an lipid a baineadh as Gas1-GFP le MS mar a thuairiscítear (50). Go hachomair, rinneadh stiallacha PVDF ina raibh GPI-lipid a athfhionraí i dtuaslagóir múnla diúltach 75μl [clóraform/meatánól (1:2) + 5 mM aicéatáit amóiniam] agus rith siad anailís ianúcháin leictreaspraeála (ESI)-MRM/MS ar speicis sphingolipid (TSQ Vantage). Sa chás seo, fuarthas sonraí MS i mód ian diúltach.
Mar a luadh cheana, scaradh cuid lipid ancaire GPI ón GPI-AP lipéadaithe le [3H]-inositol (16). Scaradh na lipidí trí chrómatagrafaíocht shraithe tanaí ag baint úsáide as córas tuaslagóra (55:45:10 clóraform-meatánól-0.25% KCl) agus rinneadh iad a shamhlú ag baint úsáide as FLA-7000 (Fujifilm).
Níodh na cealla a raibh Gas1-GFP (600 × 107) iontu faoi dhó le maolán TNE, agus bristeadh iad le coirníní gloine, agus ansin rinneadh iad a lártheifneoiriú chun smionagar cille agus coirníní gloine a bhaint. Ansin rinneadh an forshnáithín a lártheifneoiriú ag 17,000 g ar feadh 1 uair an chloig ag 4°C. Níodh an milléad in TNE agus goradh é le 1 U PI-PLC (Invitrogen) i TNE ina raibh 0.2% saponin digitalis ar feadh 1 uair an chloig ag 37°C. Tar éis na cóireála einsíme, baineadh an scannán trí lártheifneoiriú ag 17,000 g ag 4°C ar feadh 1 uair an chloig. Chun Gas1-GFP a imdhíon-dheascadh, goradh an forshnáithín le GFP-Trap_A (ChromoTek) ag 4°C thar oíche. Daiteadh an Gas1-GFP íonaithe a scartha le SDS-PAGE le gorm lonrach Coomassie. Gearradh an banda staining Gas1-GFP ón liath a bhí timpeall an uisceadáin, agus ansin, tar éis ailciliúcháin le hiaidéacéitimíd agus laghdú le déthiothreitol, rinneadh díleá in-glóthach le trypsin. Eastóscadh agus triomú na peiptídí tryptacha agus na peiptídí le GPI-glicáin. Tuaslagadh an peiptíd triomaithe i 20 μl uisce. Instealladh cuid (8μl) isteach san LC. Baineadh úsáid as colún ochtadeicilsiláin (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; trastomhas istigh 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Réigiún Aichi, an tSeapáin) chun peiptídí a dheighilt faoi choinníollacha grádáin shonracha. Is é an chéim shoghluaiste tuaslagóir A (0.08% aigéad formach) agus tuaslagóir B (0.15% aigéad formach in 80% aicéatóinítríl). Baineadh úsáid as córas Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) chun an colún a dhí-eluáil le tuaslagóir A laistigh de 55 nóiméad ag ráta sreafa 50 μl nóim-1 ar feadh 5 nóiméad, agus ansin méadaíodh tiúchan tuaslagóra B go 40%. , Stáit Aontaithe Mheiriceá). Tugadh an dí-eluáil isteach go leanúnach sa fhoinse ian ESI, agus rinneadh anailís ar na peiptídí tryptacha agus na peiptídí le GPI-glicáin le LTQ Orbitrap XL (speictriméadar maise hibrideach gaiste ian líneach-fhithiseach; Thermo Fisher Scientific). Sa socrú MS, socraíodh voltas na foinse ribeadáin go 4.5 kV, agus coinníodh teocht an ribeadáin aistrithe ag 300°C. Socraíodh an voltas ribeadáin agus voltas lionsa an fheadáin go 15 V agus 50 V, faoi seach. Fuarthas sonraí MS sa mhodh ian dearfach (taifeach 60,000; cruinneas maise 10 gcuid in aghaidh an mhilliúin) i raon maise de chóimheas maise/luchta 300/m/z (m/z) 3000. Faightear na sonraí MS/MS tríd an ngaiste ian san LTQ Orbitrap XL [na chéad 3 dhigit ar a mbraitheann na sonraí, dícheangal de bharr imbhuailte (CID)].
Rinneadh insamhaltaí MD ag baint úsáide as bogearraí GROMACS (52) agus réimse fórsa MARTINI 2 (53-55). Baineadh úsáid as an CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ansin chun déchiseal a thógáil ina raibh dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) agus Cer C18 nó DOPC agus Cer C26. Díorthaítear toipeolaíocht agus comhordanáidí Cer C26 ó DXCE trí na coirníní breise a bhaint as eireaball an tsfingosine. Bain úsáid as an bpróiseas a thuairiscítear thíos chun an déchiseal a chothromú agus é a rith, ansin bain úsáid as comhordanáidí deiridh an chórais chun córas a thógáil ina bhfuil Emp24. Tógadh fearann ​​tras-membrane an ghiosta Emp24 (iarmhair 173 go 193) mar α-héilics ag baint úsáide as struchtúr móilíneach uirlis amhairc MD (VMD) (58). Ansin, tar éis na lipidí forluiteacha a bhaint, rinneadh an próitéin a ghránú go garbh agus a chur isteach sa déchiseal ag baint úsáide as CHARMM GUI. Tá 1202 DOPC agus 302 Cer C26 nó 1197 DOPC agus 295 Cer C18 agus Emp24 sa chóras deiridh. Ianaigh an córas go dtí tiúchan 0.150M. Rinneadh ceithre mhacasamhlú neamhspleácha do dhá chomhdhéanamh déchiseal.
Déantar an déchiseal lipid a chothromú ag baint úsáide as an bpróiseas CHARMM GUI, lena n-íoslaghdaítear agus ansin cothromaítear 405,000 céim, áit a laghdaítear agus a dhíchuirtear na srianta suímh de réir a chéile, agus méadaítear an chéim ama ó 0.005 ps go 0.02 ps. Tar éis cothromaíochta, táirgeann sé 6 µs le céim ama de 0.02 ps. Tar éis Emp24 a chur isteach, bain úsáid as an bpróiseas CHARMM GUI céanna chun an córas a íoslaghdú agus a chothromú, agus ansin rith ar feadh 8 soicind i dtáirgeadh.
I gcás gach córais, le linn an phróisis chothromúcháin, rialaítear an brú leis an mbarostat Berendsen (59), agus le linn an phróisis táirgthe, rialaítear an brú leis an mbarostat Parrinello-Rahman (60). I ngach cás, is é 1 bar an meánbhrú agus úsáidtear scéim cúplála brú leath-iseatrópach. Sa phróiseas cothromúcháin agus táirgthe, úsáidtear teirmeastat (61) le hathchalabrú luais chun teocht na gcáithníní próitéine, lipid agus tuaslagóra a chúpláil faoi seach. Le linn na hoibríochta ar fad, is é 310K an teocht sprice. Ríomhtar an t-idirghníomhaíocht neamhnasctha trí liosta péireála a ghiniúint ag baint úsáide as scéim Verlet le lamháltas maoláin 0.005. Ríomhtar an téarma Coulomb ag baint úsáide as an réimse imoibrithe agus fad scoite de 1.1 nm. Úsáideann an téarma Vander Waals scéim scoite le fad scoite de 1.1 nm, agus úsáidtear scéim scoite Verlet le haghaidh drift féideartha (62).
Ag baint úsáide as VMD, is é 0.7 nm an tonnfhad scoir idir coirníní fosfáite DOPC nó coirníní ceirimíde AM1 agus an próitéin, agus ríomhtar líon na lipidí a idirghníomhaíonn leis an bpróitéin. De réir na foirmle seo a leanas, ríomh an fachtóir ídithe-saibhrithe (DE) mar atá i (63): fachtóir DE = (méid na lipidí iomlána sa phróitéin 0.7) sa phróitéin 0.7 (méid Cer i lipidí iomlána)
Faightear an luach tuairiscithe mar mheán, agus is ceithre chóip neamhspleácha de SE na barraí earráide. Ríomhtar suntasacht staitistiúil an fhachtóra DE trí thástáil t [(meán-fhachtóirDE-1)/SE]. Ríomh an luach P ón dáileadh aon-eireaballach.
Baineadh úsáid as an uirlis GROMACS chun léarscáil dlúis cliathánach 2T den chóras ina bhfuil Emp24 a ríomh laistigh de na 250 ns deireanacha den rian. Chun léarscáil saibhrithe/ídithe ceirimíde a fháil, roinntear léarscáil dlúis Cer ar shuim léarscáil Cer agus DOPC, agus ansin roinntear í ar thiúchan Cer sa chorp. Úsáidtear an scála léarscáile datha céanna.
Le haghaidh ábhar breise don alt seo, féach http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Is alt rochtana oscailte é seo atá dáilte faoi théarmaí an Cheadúnais Creative Commons Attribution-Non-Commercial, a cheadaíonn an úsáid, an dáileadh agus an atáirgeadh in aon mheán, fad is nach chun críche tráchtála atá an úsáid deiridh agus gurb é an bunphrionsabal go bhfuil an saothar bunaidh ceart. Tagairt.
Nóta: Ní iarrann muid ort ach do sheoladh ríomhphoist a sholáthar ionas go mbeidh a fhios ag an duine a mholann tú don leathanach gur mian leat go bhfeicfidís an ríomhphost agus nach turscar é. Ní ghabhfaimid aon seoltaí ríomhphoist.
Úsáidtear an cheist seo chun tástáil a dhéanamh an cuairteoir thú agus chun cosc ​​a chur ar chur isteach turscair uathoibríoch.
Sóifia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero, Ana Maria Perez-Linegio (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Nochtann íomháú fíor-ama ardtaifigh 3T an tábhacht a bhaineann le fad slabhra ceirimíde maidir le sórtáil próitéine i suíomhanna aschuir roghnacha.
Sóifia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero, Ana Maria Perez-Linegio (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Nochtann íomháú fíor-ama ardtaifigh 3T an tábhacht a bhaineann le fad slabhra ceirimíde maidir le sórtáil próitéine i suíomhanna aschuir roghnacha.
©2020 Cumann Meiriceánach um Chur Chun Cinn na hEolaíochta. gach ceart ar cosaint. Tá AAAS ina chomhpháirtí de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. EolaíochtAdvances ISSN 2375-2548.