Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó mód comhoiriúnachta a mhúchadh in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánfaimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Murab ionann agus veirteabraigh, meastar go forleathan nach bhfuil hormóin stéaróideacha gnéis claonta i bhfear ag feithidí. In Anopheles gambiae, is cosúil gur éabhlóidigh an stéaróideach ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) chun forbairt uibheacha a rialú nuair a shintéisiú ag baineannaigh2 agus chun tréimhse teasfhulangach cúplála a spreagadh nuair a aistrítear go gnéasach iad ag fireannaigh3. Ós rud é gur tréithe atáirgthe riachtanacha iad forbairt uibheacha agus cúpláil, d’fhéadfadh tuiscint a fháil ar an gcaoi a gcomhtháthaíonn moscítí baineann Anopheles na comharthaí hormónacha seo dearadh clár nua rialaithe maláire a éascú. Anseo, nochtann muid go rialaítear na feidhmeanna atáirgthe seo ag stéaróidigh ghnéis ar leith trí líonra casta einsímí gníomhachtaithe/díghníomhachtaithe ecdysteroid. D’aithin muid ecdysone ocsaídithe fireann-shonrach, 3-dehydro-20E (3D20E), a chosnaíonn tuismitheoireacht trí ghlacthacht ghnéasach baineann a dhúnadh tar éis aistrithe gnéis agus gníomhachtaithe trí dhífhosfaraileadh. Is suntasach gur spreag aistriú 3D20E freisin léiriú géinte atáirgthe a chothaíonn forbairt uibheacha le linn ionfhabhtaithe Plasmodium, rud a chinntíonn sláinte na mban ionfhabhtaithe. Ní spreagann 20E díorthaithe ó bhaineannaigh freagairt ghnéasach, ach tugann sé deis d’aonáin cúplála uibheacha a leagan tar éis cosc ​​a chur ar chináisí a chuireann cosc ​​ar 20E. Tugann sainaithint an hormóin stéaróidigh seo atá sainiúil don fhireann agus a ról i rialáil glacthachta gnéis, torthúlachta agus idirghníomhaíochta baineann le Plasmodium le fios go bhfuil an poitéinseal ann rath atáirgthe mosquitoí a tharchuireann maláire a laghdú.
Tá cásanna agus básanna maláire ag méadú arís4 mar gheall ar fhriotaíocht fhorleathan in aghaidh lotnaidicídí i measc moscítí Anopheles, an t-aon veicteoir de pharasítí maláire daonna. Is sprioc thar a bheith tarraingteach í bitheolaíocht cúplála na moscítí seo d’idirghabhálacha nua rialaithe maláire toisc nach ndéanann baineannaigh cúpláil ach uair amháin5; dá ndéanfaí an t-aon imeacht cúplála seo a steiriliú, bheadh ​​​​acmhainneacht mhór ann chun daonraí moscítí sa réimse a laghdú.
Éiríonn mná éagumasach go gnéasach tar éis dóibh hormóin stéaróideacha ard-titre a fháil ó fhir. Léirigh staidéir gurb é 20-hiodrocsai-ecdysone (20E) an spreagadh le haghaidh deacrachta i dtréimhse cúplála breise, hormón stéaróideach ar a dtugtar níos fearr mar rialtóir an timthrialla leáite i gcéim an larbhaigh. Tá cumas na bhfireannach 20E a shintéisiú agus a aistriú tar éis teacht chun cinn go sonrach i speicis Anopheles atá mar chuid den fhoghéineas Cellia7, atá dáilte san Afraic agus lena n-áirítear na veicteoirí maláire is contúirtí, lena n-áirítear Anopheles gambiae. Tá sé seo suntasach go háirithe mar sna speicis seo táirgeann baineannaigh 20E freisin tar éis gach béile fola, agus tiomáineann 20E an timthriall oogenesis (féach tag. 8). Mar sin féin, is beag atá ar eolas faoin gcaoi a gcomhtháthaíonn baineannaigh comharthaí ó dhá fhoinse éagsúla ecdysone (aistriú fireann agus ionduchtú beathaithe fola) gan cur isteach ar a gcumas féin cúplála. Déanta na fírinne, má spreagann an 20E a tháirgeann na baineannaigh éadulaingt ghnéasach, beidh neamhthorthúlacht mar thoradh air seo in daoine aonair a bheathaíonn maighdean, iompar an-choitianta sna mosquitos seo5.
Míniú féideartha is ea go n-aistríonn fireannaigh A. gambiae ecdysone modhnaithe atá sainiúil don fhireann, rud a ghníomhaíonn easghluaiseacht comharthaíochta sa chonair atáirgthe baineann, rud a fhágann éagobhsaíocht cúplála. Mar sin féin, cé go bhfuil il-hormóin stéaróideacha ag veirteabraigh, amhail estrogen agus andrógen (athbhreithnithe i dtagairt 9), chomh fada agus is eol dúinn, níor aithníodh stéaróidigh claonta andrógenacha i bhfeithidí.
Chuireamar romhainn stór na hormón stéaróideach a chinneadh i faireog fhireann fhireann (MAG) A. gambiae aibí go gnéasach agus muid ag cuardach stéaróidigh mhodhnaitheach féideartha. Ag baint úsáide as crómatagrafaíocht leachtach ardfheidhmíochta in éineacht le mais-speictriméadracht tandem (HPLC-MS/MS) seachas an modh nach raibh chomh sainiúil a úsáideadh roimhe seo, bhraith muid ecdysone (E) agus 20E sa fhíochán seo, rud a dheimhnigh an toradh roimhe seo. Mar sin féin, bhí stéaróidigh ocsaídithe fosfarailithe i réim sa sampla, ag teacht leis an bhfoirmle 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Fíor 1). I measc na bhfoirmeacha eile tá 3-dehydro-20E (3D20E) agus 20E-22-phosphate (20E22P). Bhí déine comhartha HPLC-MS/MS 3D20E22P dhá ord méide níos airde ná a fhoirm dhífhosfarailithe, 3D20E, agus trí ord méide níos airde ná déine E agus 20E (Fíor 1). Cé go bhfuil sé i gcodanna eile den chorp agus sa... conair atáirgthe íochtarach (LRT; Sonraí Leathnaithe Fíor 1a). Rinneamar anailís freisin ar eicdisteroidí i bhfireannaigh agus i mbaineannaigh a dúnadh le déanaí (<1 lá d'aois) agus bhraith muid 3D20E agus 3D20E22P i MAG amháin; bhí E, 20E agus 20E22P i láthair sa dá inscne (Sonraí Leathnaithe Fíor 1b). Tugann na sonraí seo le fios go dtáirgeann fireannaigh fásta A. gambiae teidil arda hormóin mhodhnaitheach ina gcuid MAGanna nach ndéanann baineannaigh a shintéisiú.
Díscaoileadh MAG agus LRT baineann (lena n-áirítear atria, veicilí seimineacha, agus parovarium) ó fhir mhaighdean 4 lá d'aois (4 lá d'aois) agus ó bhaineannaigh mhaighdean agus cúpláilte (0.5, 3, agus 12 hpm). Rinneadh anailís ar Ecdysone sna fíocháin seo le HPLC-MS/MS (meán ± sem; tástáil-t neamhphéireáilte, dhá thaobh, ráta fionnachtana bréagach (FDR) ceartaithe; NS, gan suntas; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 uair an chloig vs. 0.5 uair an chloig, P = 0.035; 12 uair an chloig vs. 3 uair an chloig, P = 0.0015; 12 uair an chloig vs. 0.5 uair an chloig, P = 0.030. 3D20E22P: 3 uair an chloig vs. 0.5 uair an chloig, P = 0.25; 12 uair an chloig vs. 3 uair an chloig, P = 0.0032; 12 uair an chloig vs. 0.5 uair an chloig, P = 0.015). Tagann na sonraí ó thrí mhacasamhlú bitheolaíoch. Rinneadh an buaiclimistéar do gach ecdysone a raibh suim ann a ríomh agus a normalú de réir líon na mosquitoí. Léirítear ecdysone le dath mar seo a leanas: E, glas; 20E, oráiste; 20E22P, corcra; 3D20E, gorm; 3D20E22P, bándearg. Méadaíonn an t-ionchur an scála ar an ais-y chun leibhéil ecdysone níos ísle a thaispeáint.
Chun imscrúdú a dhéanamh an aistrítear 3D20E22P agus 3D20E le linn cúplála, rinneamar díscaoileadh ar LRTanna baineann ag pointí ama éagsúla tar éis cúplála. Cé nach bhfuarthas ecdysone i maighdeana, thugamar faoi deara méideanna suntasacha de 3D20E22P san LRT díreach tar éis cúplála (0.5 uair an chloig tar éis cúplála, hpm), ag laghdú le himeacht ama, agus mhéadaigh leibhéil 3D20E go suntasach (Fíor 1). Agus 3D20E sintéisithe go ceimiceach á úsáid mar chaighdeán, chinnteamar go raibh leibhéil an hormóin stéaróidigh seo i LRTanna cúplála 100 uair níos airde ar a laghad ná 20E (Tábla Sonraí Leathnaithe 1). Dá bhrí sin, is é 3D20E22P an príomh-ecdysone fireann a aistrítear chuig an LRT baineann le linn cúplála, agus bíonn a fhoirm dífhosfaraithe, 3D20E, an-flúirseach go gairid tar éis cúplála. Tugann sé seo le fios go bhfuil ról tábhachtach ag an ecdysone deireanach sin i mbitheolaíocht iar-chúplála baineann.
Tar éis tacar sonraí nua seicheamhúcháin RNA (RNA-seq) a ghiniúint (Fíor 2a), ag baint úsáide as píblíne bithfhaisnéise saincheaptha, chuardaíomar ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), agus ecdysone a ionchódaíonn géin fosfatáis modhnaithe 20E. Léirítear EPP) i bhfíocháin atáirgthe. Aithníomar géin EPP iarrthóra amháin agus dhá ghéin EcK fhéideartha (EcK1 agus EcK2), ach ní raibh muid in ann géin EO iarrthóra maith a aimsiú. Is suntasach gur léiríodh géinte EPP aonair ag leibhéil arda (98.9ú peircintíl) i MAGanna Gambian ach ní i LRTanna baineann (Fíor 2b), contrártha lenár n-ionchais ó tharla dífhosfaraileadh 3D20E22P sa fhíochán baineann seo. Dá bhrí sin, creidimid gur féidir EPP fireann a aistriú le linn cúplála. Go deimhin, d'úsáideamar lipéadú iseatóp cobhsaí in vivo chun an próitéin baineann a cheilt tar éis cúplála, einsím a shainaithnítear le MS san aitriam baineann (Fíor 2c agus Tábla Forlíontach 1). Láithreacht Deimhníodh EPP i MAG agus LRT baineann cúpláilte (ach ní maighdean) ag baint úsáide as antashubstaintí sonracha freisin (Fíor 2d).
a, Píblíne bithfhaisnéise saincheaptha chun fíocháin atáirgthe gach inscne a chuardach le haghaidh géinte a ionchódaíonn EcKanna, EOanna, agus EPPanna. Léiríonn na huimhreacha in aice leis na saigheada líon na n-iarrthóirí fireann agus baineann ag gach céim. Sainaithin an anailís seo géin EPP amháin (EPP) agus géin EcK amháin (EcK1) a chuirtear in iúl i bhfireannaigh, agus géin EcK amháin (EcK2) a chuirtear in iúl sa dá inscne ach nach dtugann géin EO iarrthóra.b, Léarscáil Teasa ina ndéantar comparáid idir léiriú géine iarrthóra i bhfíocháin Anopheles gambiae agus Anopheles albicans maighdean (V) agus cúplála (M).Spca, toirchiú; MAGanna, faireoga cúnta i bhfireannaigh; codanna eile den chorp, lena n-áirítear cíocha, sciatháin, cosa, coirp ramhar, agus orgáin inmheánacha sa dá inscne, agus ubhagáin i measc na mbaineannach. Tá EcK2 léirithe go hard i MAG agus in atria na Gaimbia araon, ach ní fhaightear EPP ach i MAG.c, Anailís phróitéómach ar aistriú grúpa ejaculate fireann isteach in atria baineann ag 3, 12 agus 24 hpm, ag taispeáint na 67 próitéin is flúirseach. Tógadh baineannaigh ar aiste bia ina raibh 15N chun na próitéiní go léir a lipéadú (agus a cheilt). Péireáladh fireannaigh neamhchlibeáilte le baineannaigh chlibeáilte, agus díchóimeáladh LRTanna baineann ag 3, 12 agus 24 hpm le haghaidh anailíse próitéóime (féach Tábla Forlíontach 1 le haghaidh liosta iomlán de phróitéiní ejaculating). Isteach, braitheadh ​​EPP, Eck1 agus EcK2 i MAG na bhfear maighdean trí anailís phróitéóime ar na fíocháin seo.d, braitheadh ​​EPP trí western blot i MAG agus LRT na mbaineannach cúpláilte, ach ní i mbaineannaigh nó fireannaigh maighdean ná sa chuid eile de chorp na baineannach. Rinneadh seicní a dhíchur ag an am céanna Rinneadh tástáil orthu le frith-aictin (rialú lódála) agus frith-EPP. Is maighdeana iad na fireannaigh uile. Féach ar Fíor Forlíontach 1 le haghaidh sonraí foinse glóthaí. Rinneadh blotanna Thiar faoi dhó le torthaí comhchosúla.
Fíoraíodh gníomhaíocht fosfatase éicdistéaróideach EPP tar éis goradáin trí HPLC-MS/MS le 3D20E22P arna leithlisiú ó MAG (Sonraí Leathnaithe Fíor 2a). Ina theannta sin, nuair a chuireamar EPP ina dtost trí chur isteach RNA-mheánach (RNAi), bhraith muid laghdú láidir ar ghníomhaíocht fosfatáis i bhfíocháin atáirgthe na bhfireannach seo (Fíor 3a), agus léirigh baineannaigh a cúpláladh le fireannaigh a raibh EPP ina dtost orthu cion suntasach níos ísle de 3D20E dífhosfarailithe (Fíor 3b) in ainneoin tostú géine páirteach (Sonraí Leathnaithe Fíor 2b,c). I gcodarsnacht leis sin, níor bhraith muid athruithe suntasacha sa chóimheas 20E22P/20E sna corrmhíolta céanna, rud a d'fhéadfadh a thabhairt le fios go bhfuil an einsím sainiúil do 3D20E22P (Fíor 3b).
a, Laghdú ar ghníomhaíocht fosfatáise i MAG de bharr tostú EPP ag baint úsáide as rialuithe RNA EPP dé-shnáithe (dsEPP) nó RNA GFP dé-shnáithe (dsGFP). Baineadh úsáid as fiche linn snámha MAG i ngach macasamhail (P = 0.0046, tástáil-t péireáilte, dhá thaobh), léirithe ag poncanna ar leithligh.b, Bhí cion i bhfad níos ísle de 3D20E dífhosfarailithe ag 3 hpm ag baineannaigh a cúpláladh le fireannaigh a raibh EPP tosta orthu (P = 0.0043, tástáil-t neamhpéireáilte, dhá thaobh), ach níor difear do leibhéil 20E (P = 0.063, neamhpéireáilte). tástáil-t, déthaobhach). Cuirtear sonraí i láthair mar mheán ± sem ó thrí chomhthiomsú de 13, 16 agus 19 baineannach an ceann.c, Bhí rátaí athchúrsála i bhfad níos airde ag baineannaigh a cúpláladh le fireannaigh a raibh EPP tostaithe orthu (P = 0.0002, tástáil chruinn Fisher, déthaobhach). Cuireadh iallach ar bhaineannaigh cúpláil ar dtús chun a stádas cúplála a chinntiú; 2 lá ina dhiaidh sin, rinneadh teagmháil leo le fireannaigh eile a raibh speirm thrasghéineach acu chun rátaí athchúrsála a mheas trí bhrath PCR cainníochtúil ar an trasghéin.d, Bhí torthúlacht laghdaithe go suntasach ag baineannaigh a beathaíodh le fuil agus a cúpláladh le fireannaigh a raibh EPP tostaithe orthu (P < 0.0001; tástáil Mann-Whitney, dhá thaobh) agus líon uibheacha laghdaithe beagán (P = 0.088, tástáil Mann-Whitney, dhá thaobh), agus níor cuireadh isteach ar an ráta sceathraí (P = 0.94, tástáil chruinn Fisher, dhá thaobh).I ngach painéal, léiríonn n líon na samplaí corrmhíolta atá neamhspleách ó thaobh na bitheolaíochta de.NS, níl sé suntasach.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Ansin, rinneamar measúnú ar cibé an bhfuil dífhosfaraileadh ecdysone tábhachtach chun friotaíocht cúplála a spreagadh i measc na mbaineannach. Is suntasach gur athchúráladh baineannaigh a chúpláladh le fireannaigh a raibh EPP ídithe acu ag minicíocht i bhfad níos airde (44.9%) ná baineannaigh rialaithe (10.4%) nuair a nochtadh iad do fhir bhreise (trasghéineacha) (Fíor 3c). Thugamar faoi deara laghdú suntasach ar thorthúlacht freisin (Fíor 3d, ar chlé) agus laghdú beag ar líon na n-uibheacha a leag na baineannaigh seo (Fíor 3d, lár), agus níor cuireadh isteach ar chéatadán na n-uibheacha a leag baineannaigh (freagra eile a spreagadh i measc na mbaineannach trí chúpláil)) (Fíor 3d, ar dheis). I bhfianaise na sainiúlachta breathnaithe de EPP do 3D20E22P, tugann na torthaí seo le fios go bhféadfadh ról tábhachtach a bheith ag gníomhachtú 3D20E ag EPP a aistrítear le linn cúplála i múchadh glacthacht baineann le haghaidh cúplála breise, iompar a cuireadh i leith aistriú gnéasach 20E roimhe seo. Dá bhrí sin, bíonn tionchar láidir ag an hormón fireann-shonrach seo ar thorthúlacht baineann freisin.
Ansin, rinneamar comparáid idir gníomhaíochtaí 20E agus 3D20E i dturgnaimh insteallta i maighdeana aibí go gnéasach ag baint úsáide as 3D20E sintéisithe go ceimiceach (Fíor 4a–c) agus 20E atá ar fáil go tráchtála. Thugamar faoi deara go raibh 3D20E i bhfad níos éifeachtaí ná 20E maidir le híogaireacht baineannach don chúpláil a mhúchadh ag an dá thiúchan (Fíor 4d). Is suntasach gur spreag leath an leibhéil fhiseolaíoch de 3D20E san LRT (1,066 pg tar éis insteallta vs. 2,022 pg tar éis cúplála) cion de bhaineannaigh teasfhulangacha a bhí 20 uair níos airde ná leibhéal fiseolaíoch 20E (361 pg tar éis insteallta) 24 uair an chloig tar éis insteallta ag an tiúchan is airde 18 pg tar éis cúplála; Tábla Sonraí Leathnaithe 1). Tá an toradh seo ag teacht leis an tuairim nach mbíonn tréimhsí teasfhulangacha cúplála mar thoradh ar aistriú gnéasach 20E, agus tugann sé le fios freisin gur fachtóir mór é 3D20E chun an caidreamh tuismitheora-linbh a chinntiú. Bhí 3D20E i bhfad níos gníomhaí ná 20E i dtástálacha breithe uibheacha i mbaineannaigh mhaighdean (Fíor 4e), rud a thugann le fios gur mar gheall ar ghníomhaíocht iarmharach 3D20E a tháirgtear fós ag fachtóirí baineannaigh a spreagtar le cúpláil a bhí an gnáthráta breithe uibheacha a breathnaíodh againn tar éis tostú páirteach EPP.
(a,b) 3D20E sintéisithe go ceimiceach ó 20E (a) le comhshó/éifeachtúlacht an-ard (sonraí curtha i láthair mar mheán ± sem ó thrí imoibriú sintéise neamhspleácha) (b).c, Meaitseálann an speictream maise (leath bun) go díreach ecdysone a fhaightear i LRT baineann cúpláilte (leath uachtarach).d, I gcomparáid le 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; tástáil chruinn Fisher, dhá thaobh) agus 10% eatánól (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; tástáil chruinn Fisher, dhá thaobh), agus bhí 20E i bhfad níos airde ná an rialú ag dáileoga níos airde amháin (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; tástáil chruinn Fisher, dhá thaobh).e, 3D20E Spreag instealladh rátaí sceite i bhfad níos airde i measc baineannaigh mhaighdeana ná mar a bhí i rialuithe 10% eatánóil (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; tástáil chruinn Fisher, dhá thaobh), agus 20E i gcomparáid le rialuithe ag dáileoga níos airde amháin (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; tástáil chruinn Fisher, dhá thaobh). Spreag 3D20E rátaí sceite i bhfad níos airde ná 20E ag dáileoga níos airde (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; tástáil chruinn Fisher, dhá thaobh). I ngach painéal, seasann n do líon na samplaí corrmhíolta neamhspleácha ó thaobh na bitheolaíochta de. NS, gan suntas. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Is ó trí mhacasamhlú.
I staidéir roimhe seo, chinneamar go spreagann aistriú gnéasach hormóin stéaróideach léiriú MISO (Spreagthóir Oogenesis de bharr Cúplála 11), géin atáirgthe baineann a chosnaíonn baineannaigh A. gambiae ó ionfhabhtú P. falciparum. Costais sláinte de bharr 13, an seadán maláire daonna is marfaí. I bhfianaise thábhacht MISO maidir le folláine atáirgthe Anopheles i gceantair ina bhfuil maláire dúchasach, shocraíomar a chinneadh cé acu hormón 3D20E nó 20E a spreagann léiriú an ghéin seo. Fuaireamar amach, cé gur spreag instealladh 20E roinnt gabhdóirí hormóin núicléacha (HR), amhail HR3 agus HR4, agus spriocanna stéaróideacha tipiciúla iartheachtacha, amhail na géinte buíocáin Vg14, 15, 16, go sonrach nó níos láidre, gur spreag 3D20E MISO níos láidre (Fíor Sonraí Leathnaithe 3). Dá bhrí sin, is cosúil go spreagann aistriú gnéasach an hormóin stéaróidigh andraigineach seo meicníochtaí a chosnaíonn baineannaigh ó na costais a bhaineann le hionfhabhtú seadánach. Ina theannta sin, bíonn tionchar difriúil ag 3D20E ar an dá isoform den... gabhdóir E EcR, ag spreagadh EcR-A agus ag cur cosc ​​ar EcR-B, agus ag spreagadh géinte eile a spreagann cúpláil níos láidre, lena n-áirítear HPX15, a théann i bhfeidhm ar thorthúlacht na mban. D’fhéadfadh sé seo an neamhthorthúlacht shuntasach a breathnaíodh i mbaineannaigh a chúpláiltear le fireannaigh a bhfuil EPP-tostaithe acu a mhíniú (Fíor 3 de Shonraí Leathnaithe). Tugann na sonraí seo le fios go bhfuil conairí iartheachtacha ann a ghníomhaítear go roghnach ag dhá hormón ecdysone a d’fhéadfadh a bheith mar bhunús le feidhm inscne-shonrach.
Ansin, rinneamar tástáil ar fheidhm an dá ghéin EcK a sainaithníodh inár bpíblíne bithfhaisnéise. Mar thoradh ar EcK1 nó EcK2 a thostú, bhí básmhaireacht shuntasach i measc na bhfear (Fíor Sonraí Leathnaithe 4a), rud a thugann le fios go bhfuil fosfaraileadh ecdysone, agus dá bhrí sin díghníomhachtú, tábhachtach don mharthanas. Ós rud é gur léiríodh EcK2 ag leibhéil níos airde ná EcK1 agus gur braitheadh ​​é i MAGanna trí phróitéamaíocht (Fíor 2b, c agus Tábla Forlíontach 2), dheimhnigh muid a ghníomhaíocht ecdysteroid kinase trína ghoradh le 20E, rud a d'eascair fosfaraileadh 20E22P (Fíor Sonraí Leathnaithe 2).4b). Agus 3D20E á úsáid mar shubstráit, ní raibh muid in ann an táirge fosfarailithe 3D20E22P a bhrath (Fíor Sonraí Leathnaithe 4c), rud a thugann le fios gurbh é 20E seachas 3D20E an sprioc is fearr le haghaidh EcK2.
De réir ár n-anailíse RNA-seq, bhí EcK2 léirithe go hard i LRT na mbaineannach maighdean freisin, áit ar múchadh é tar éis cúplála (Fíor 2b). Dheimhnigh muid na sonraí seo agus chinn muid nach raibh tionchar ag beathú fola ar léiriú EcK2 (Fíor Sonraí Leathnaithe 5a). Ag leathnú ár dturgnaimh MS tosaigh, chinn muid go raibh baint dlúth ag buaic 20E22P le buaic 20E (22-26 uair an chloig tar éis béile fola; Fíor Sonraí Leathnaithe 5b). Mar thoradh ar thostú EcK2 i mbaineannach maighdean, tháinig méadú 3 huaire ar an gcóimheas coibhneasta idir 20E agus 20E22P ag 26 uair an chloig tar éis béile fola (Fíor Sonraí Leathnaithe 2c agus 5c), rud a dheimhníonn go ndéanann EcK2 fosfarail ar 20E i mbaineannach freisin. Is suntasach gur choinnigh maighdeana ídithe EcK2 glacacht ghnéasach iomlán (Fíor Sonraí Leathnaithe 5d,e), rud a thugann le fios nach spreagann táirgeadh 20E baineann tréimhsí teasfhulangacha cúplála. Mar sin féin, bhí tionchar suntasach ag na baineannaigh seo ar... rátaí breithe uibheacha méadaithe i gcomparáid leis na rialuithe, agus níos mó ná 30% de na maighdeana ag breith uibheacha (Fíor Sonraí Leathnaithe 5f). Mura ndearnadh instealltaí RNA Eck2 dé-shnáithe (dsEcK2) tar éis beathú fola, níor tharla sceitheadh, agus ag an bpointe sin bhí buaic 20E mar gheall ar ionghabháil fola laghdaithe. Tríd is tríd, tacaíonn na torthaí seo le samhail gur féidir le 20E a tháirgtear tar éis sú fola sceitheadh ​​a spreagadh, ach amháin nuair a mhúchtar an bloc sceite (EcK2 agus b'fhéidir fachtóirí eile) trí chúpláil. Níor chuir instealltaí 20E ná 3D20E cosc ​​ar léiriú EcK2 i maighdeana (Fíor Sonraí Leathnaithe 5g), rud a thugann le fios go mbíonn fachtóirí eile ina gcúis le cosc ​​an chináis seo. Mar sin féin, ní raibh leibhéil 20E tar éis beathú fola leordhóthanach chun míchompord cúplála a spreagadh, ach spreagadh iad go héifeachtach ag teidil arda de 3D20E a aistríodh go gnéasach.
Tugann ár dtorthaí léargas tábhachtach ar na meicníochtaí a rialaíonn rath atáirgthe A. gambiae. Tá samhail tagtha chun cinn ina bhfuil fireannaigh tar éis teacht chun cinn chun teidil arda de 3D20E a shintéisiú, ecdysone modhnaithe atá sainiúil don fhireann a chinntíonn tuismitheoireacht trí dhí-íogrú baineannaigh le haghaidh tuilleadh cúplála. Ag an am céanna, tá córas éifeachtach forbartha ag na veicteoirí maláire seo chun 3D20E a ghníomhachtú i mbaineannaigh mar fhreagairt ar aistriú gnéasach EPP atá sainiúil don fhireann. Chomh fada agus is eol dúinn, is é seo an chéad sampla de chóras hormóin stéaróideach atá faoi cheannas fireann agus baineann a chomhlíonann feidhm uathúil agus ríthábhachtach i bhfeithidí. Tá feidhm ecdysone atá sainiúil don fhireann curtha i láthair ach níor léiríodh go cinntitheach í. Mar shampla, hipitéis atá bréagnaithe go mór 18 is ea gur féidir leis an réamhtheachtaí 20E E1 na feidhmeanna seo a chomhlíonadh. Is eol go maith go spreagtar monandry i Drosophila trí aistriú gnéasach peiptídí gnéis beaga 19,20 a idirghníomhaíonn le néaróin a chuireann conair atáirgthe na mban trí ghabhdóirí peiptíde gnéis sonracha 21,22. Tá gá le tuilleadh oibre chun an comharthaíocht síos an tsruth a chinneadh. easanna atá faoi rialú 3D20E i mbaineannaigh A. gambiae agus a chinneadh an féidir na easanna seo a chaomhnú idir moscítí agus Drosophila.
I bhfianaise an ról tábhachtach atá ag 3D20E ar thorthúlacht agus ar iompar na mban a sainaithníodh inár staidéar, cuireann na conairí a threoraíonn chuig sintéis agus gníomhachtú 3D20E deiseanna nua ar fáil do straitéisí rialaithe mosquito sa todhchaí, amhail giniúint fhireann steiriúil iomaíoch i straitéisí teicneolaíochta feithidí steiriúla a úsáidtear le haghaidh scaoileadh fiáin nó chun aithris a dhéanamh ar an 3D20E i súgradh maighdean. B’fhéidir gur athraigh feidhm shonrach fhireann 3D20E nuair a fuair A. gambiae agus speicis Cellia eile an cumas a seamhan a théachtadh i mblocóidí cúplála, toisc go gceadaíonn sé seo aistriú éifeachtach líon mór hormóin agus einsímí gníomhachtaithe hormóin. Ina dhiaidh sin, soláthraíonn éabhlóid 3D20E a chuireann monandry i bhfeidhm meicníocht do bhaineannaigh (trí ard-léiriú MISO) chun a n-aclaíocht atáirgthe a fheabhsú i gceantair ina bhfuil leitheadúlacht ard maláire, rud a chuireann go hindíreach le tarchur Plasmodium. Ós rud é gur léiríodh go bhfuil éifeachtaí móra ag 20E baineann ar mharthanas agus ar fhás P. falciparum i mosquitos Anopheles baineann,24 is gnéithe tábhachtacha d’idirghníomhaíochtaí mosquito-parasite iad conairí hormóin stéaróideacha fireann agus baineann araon anois.
Tógadh cineálacha G3 de A. gambiae faoi choinníollacha caighdeánacha feithidí (26-28 °C, taiseachas coibhneasta 65-80%, fótathréimhse solais/dorchadas 12:12 uair an chloig). Beathaigh na larbhaí le bia éisc púdraithe (Calóga TetraMin Tropical, Millíní Koi agus Bataí Locháin Tetra i gcóimheas 7:7:2). Beathaigh na moscítí fásta tuaslagán deasglúise 10% agus fuil dhaonna seachtainiúil (staidéar a dhéanamh ar chomhpháirteanna fola). Fuarthas moscítí maighdeana trí na hinscní a dheighilt ag céim na bpupaí tar éis na foircinn a scrúdú le micreascópacht. Rinneadh cur síos roimhe seo ar fhireannaigh a iompraíonn an trasghéin DsRed.
Rinneadh turgnaimh cúplála éigeantaigh de réir na bprótacal a thuairiscíodh roimhe seo. I gcás cúplála nádúrtha, coinníodh baineannaigh mhaighdeana 4 lá d'aois i gcóimheas 1:3 le fireannaigh mhaighdeana aibí go gnéasach ar feadh dhá oíche. I gcás turgnaimh inar instealladh dsEPP sna fireannaigh, tharla an chomh-chaighean le laethanta 3-4 tar éis an insteallta, nuair a bhí gníomhaíocht fosfatáise tostaithe ag an uasmhéid (Fíor Sonraí Leathnaithe 2b).
Rinneadh fíocháin na mosquito, na coirp a bhí fágtha (an chuid eile den chorp), nó an corp iomlán a dhíscaoileadh i meatánól 100% agus rinneadh iad a homaiginiú le meaisín coirníní (coirníní gloine 2 mm, 2,400 rpm, 90 soicind). Seo a leanas méideanna na bhfíochán agus toirteanna meatánóil: an chuid eile den chorp, 50 i 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT baineann, 25–50 80 µl. Rinneadh an dara eastóscadh meatánóil ar an deascán leis an toirt chéanna meatánóil. Baineadh smionagar cille trí lártheifneoiriú. Cuireadh an meatánól ó na dhá eastóscadh le chéile agus triomaíodh é faoi shreabhadh nítrigine, agus ansin athfhionraíodh é sna toirteanna seo a leanas de 80% meatánóil in uisce: an chuid eile den chorp, 50 µl; MAGanna agus LRT baineann, 30 µl.
Rinneadh anailís ar shamplaí ar speictriméadar maise (ID-X, Thermo Fisher) atá cúpláilte le hionstraim LC (Vanquish, Thermo Fisher). Instealladh 5 µl den sampla i gcolún 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) a coinníodh ag 25 °C. Ba iad na céimeanna soghluaiste don LC A (uisce, 0.1% aigéad formach) agus B (aicéatóinítríl, 0.1% aigéad formach). Seo a leanas grádán an LC: 5% B ar feadh 1 nóiméad, ansin méadaithe go 100% B thar 11 nóiméad. Tar éis 8 nóiméad ag 100%, athchothromaigh an colún ag 5% B ar feadh 4 nóiméad. Ba é 0.3 ml min-1 an ráta sreafa. Déantar ianú sa fhoinse MS trí ianú leictreaspraeála téite i mód dearfach agus diúltach.
Tomhaiseann an mais-speictriméadar sonraí sa raon m/z ó 350 go 680 ag taifeach 60,000 i mód MS iomlán. Fuarthas sonraí MS/MS ar [M + H]+ (na spriocanna go léir), [M - H2O + H]+ (na spriocanna go léir), agus [M - H]- (spriocanna fosfarailithe). Baineadh úsáid as sonraí MS/MS chun airíonna ecdysone spriocanna nach raibh caighdeán ar fáil dóibh a dheimhniú. Chun ecdysteroidí neamhspriocdhírithe a aithint, rinneadh anailís ar shonraí MS/MS do na buaicphointí HPLC go léir le flúirse choibhneasta >15%. Cainníochtú ag baint úsáide as cuar caighdeánach a cruthaíodh ó chaighdeáin íon (20E, 3D20E) chun méideanna absalóideacha nó caoluithe sampla amháin (na spriocanna eile go léir) a ríomh chun a gcoibhéis leis na méideanna a fuarthas i bhfear amháin a ríomh. I gcás 3D20E, rinneadh cainníochtú ag baint úsáide as suim na n-adducts seo a leanas: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Baineadh sonraí amach agus cainníochtú iad ag baint úsáide as Tracefinder (leagan 4.1). Rinneadh anailís ar shonraí MS/MS ag baint úsáide as Xcalibur (leagan 4.4). Rinneadh comparáid idir speictrim MS E, 20E agus 3D20E agus na caighdeáin faoi seach. Rinneadh anailís ar 3D20E22P trí dhíorthú le himoibrí Girard. Rinneadh anailís ar 20E22P de réir cóimheas m/z.
Glanadh 3D20E22P ó MAG. Rinneadh an íonú ar scála anailíseach ag baint úsáide as crómatagraf leachtach ultra-fheidhmíochta (Acquity, Waters) le brathadóir mais-bhunaithe ceathairpholach (QDa, Acquity, Waters) faoi na coinníollacha LC céanna leis an anailís HPLC-MS/MS. Spreagadh bailiú codán nuair a braitheadh ​​an m/z a fhreagraíonn do 3D20E22P ag an am coinneála céanna a cinneadh roimhe seo. Ansin seiceáladh íonacht na gcomhdhúl eastósctha le HPLC-MS/MS mar a thuairiscítear thuas.
Baineadh RNA iomlán as 10-12 fíochán atáirgthe nó cuid eile den chorp (gan cheann) ag baint úsáide as imoibrí TRI (Thermo Fisher) de réir threoracha an mhonaróra. Rinneadh cóireáil ar RNA le TURBO DNase (Thermo Fisher). Sintéiseadh cDNA ag baint úsáide as trascríbhinn droim ar ais víreas leoicéime lucha Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) de réir threoracha an mhonaróra. Foilsíodh nó dearadh tosaitheoirí le haghaidh PCR cainníochtúil trascríobh droim ar ais (RT-qPCR; Tábla Sonraí Leathnaithe 2) roimhe seo24 nó rinneadh iad a dhearadh ag baint úsáide as Primer-BLAST26, agus tosaíocht á tabhairt do tháirgí de 70-150 bp i méid agus a shíneann thar acomhail eacsón-eacsón nó tosaitheoirí péire tosaitheoirí ag scaradh eacsóin. Caolaíodh samplaí cDNA ó thrí go ceithre mhacasamhlú bitheolaíocha ceithre huaire in uisce le haghaidh RT-qPCR. Rinneadh cainníochtú in imoibrithe macasamhla 15 µl ina raibh 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), tosaitheoirí, agus 5 µl de cDNA caolaithe. Ritheadh ​​imoibrithe ar QuantStudio 6 Pro fíor-ama. Bailíodh agus anailísíodh córas PCR (Thermo Fisher) agus sonraí ag baint úsáide as Dearadh agus Anailís (leagan 2.4.3). Mar a léiríodh sa staidéar seo, rinneadh na méideanna coibhneasta a normalú don ghéin ribosómach RpL19 (AGAP004422), nach raibh a léiriú athraithe go suntasach le beatha fola 27 nó cúpláil 3 .
Rinneadh seiceáil ar cháilíocht RNA ag baint úsáide as Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Ullmhaíodh leabharlanna péireáilte Illumina agus rith siad iad ag Broad Institute of MIT agus Harvard. Ailíníodh léamha seicheamhaithe le géanóm A. gambiae (strain PEST, leagan 4.12) ag baint úsáide as HISAT2 (leagan 2.0.5) le paraiméadair réamhshocraithe. Baineadh léamha le scóir cháilíochta mapála (MAPQ) <30 ag baint úsáide as Samtools (leagan 1.3.1). Comhaireamh líon na léamha a mapáladh chuig géinte ag baint úsáide as htseq-count (leagan 0.9.1) le paraiméadair réamhshocraithe. Ríomhadh comhaireamh léamha normalaithe agus rinneadh anailís ar léiriú géine difreálach ag baint úsáide as an bpacáiste DESeq2 (leagan 1.28.1) in R (leagan 4.0.3).
Aithníodh iarrthóirí géine a mhodhnaíonn ecdysone trí chuardach a dhéanamh ar ghéanóm A. gambiae ar dtús ag baint úsáide as an algartam PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), ag baint úsáide as luachanna réamhshocraithe Paraiméadair leis na seichimh próitéine fiosrúcháin seo a leanas: ó Bombyx mori (Uimhir Iontrála NP_001038956.1), Musca domestica (Uimhir Iontrála XP_005182020.1, XP_005175332.1 agus XP_011294434.1) agus Microplitis demolitor (Uimhir Iontrála XP_008552646.1 agus XP_008552645.1) EcK ó B. mori (Uimhir Iontrála NP_001036900), Drosophila melanogaster (Uimhir Iontrála NP_651202), Apis mellifera (Uimhir Iontrála XP_394838) agus Acyrthosiphon pisum (Uimhir Iontrála XP_001947166); agus EPP ó B. mori (Uimhir Iontrála XP_001947166) NP_001177919.1 agus NP_001243996.1) agus EO de D. melanogaster (Uimhir Iontrála NP_572986.1) (céim 1). Ansin, scag na torthaí bunaithe ar ardléiriú mRNA (>100 blúire/eacsón cileabháis in aghaidh an mhilliúin léamh mapáilte (FPKM) nó >85%) i bhfíochán atáirgthe (LRT baineann nó MAG) sa Ghaimbia (céim 2). Chun sainiúlacht a fheabhsú, roghnaíomar einsímí iarrthóra a chuirtear in iúl freisin i bhfíochán atáirgthe A. albimanus, speiceas anopheles nach ndéanann ecdysone a shintéisiú ná a aistriú le linn cúplála. Rinneadh géinte iarrthóra a scagadh bunaithe ar léiriú íseal (<100 FPKM nó <85ú peircintíl) i bhfíochán atáirgthe A. albimanus (céim 3). Mar scagaire deiridh (céim 4), ní mór do ghéinte iarrthóra ceann amháin ar a laghad díobh seo a leanas a chomhlíonadh: (1) suasrialaithe go suntasach tar éis cúplála (P < 0.05) de réir anailís na ngéinte a chuirtear in iúl go difriúil agus (2) i bhfíocháin neamh-atáirgthe (< 85% nó <100 FPKM).
Rinneamar modhnú ar na modhanna a thuairiscíodh roimhe seo 28,29,30 chun lipéadú iseatópach iomlán orgánach a bhaint amach. Go hachomair, rinneadh tástáil ar Saccharomyces cerevisiae cineál II fiáin (YSC2, Sigma) i mbonn nítrigine giosta (BD Difco, DF0335) ina raibh (meáchan/toirt) 2% glúcós (G7528, Sigma), 1.7% meán cultúir saor ó aimínaigéad agus sulfáit amóiniam) agus 5% 15N sulfáit amóiniam (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) mar an t-aon fhoinse nítrigine. Fuarthas an giosta trí lártheifneoiriú agus beathaíodh larbhaí na mosquito ad libitum go dtí go raibh siad pupáilte. Forlíonadh le min éisc (0.5 mg in aghaidh gach 300 larbhaí) chun básmhaireacht an cheathrú haois a chosc. Níor úsáideadh ach baineannaigh ansin i dturgnaimh cúplála le fireannaigh gan lipéad chun an próitéóm fireann a aistríodh le linn cúplála a anailísiú.
Cuireadh iallach ar bhaineannaigh mhaighdeana 4-6 lá d'aois, a raibh clib 15N orthu, cúpláil le fireannaigh mhaighdeana neamhchlibeáilte den aois chéanna. Fíoraíodh an cúpláil rathúil trí phlocóidí cúplála a bhrath faoi mhicreascópacht eipifluaraiseachta. Ag 3, 12, agus 24 hpm, rinneadh atria 45-55 baineannach cúpláilte a dhíscaoileadh i 50 µl de mhaolán décharbónáite amóiniam (pH 7.8) agus rinneadh iad a homaiginiú le pestle. Lártheifneoiríodh an homaigináit agus meascadh an forshnáithín le 50 µl de 0.1% RapiGest (186001860, Waters) i 50 mM décharbónáite amóiniam. Reoiteadh an forshnáithín agus an milléad ó gach sampla go tapa ar oighear tirim agus seoladh thar oíche iad chuig saotharlann MacCoss in Ollscoil Washington, áit ar críochnaíodh ullmhúchán samplach do LC-MS/MS. Athfhionraí an milléad i 50 µl de 0.1% RapiGest i 50 mM décharbónáite amóiniam agus sonaicéáil i ndabhach uisce. Tomhaiseadh tiúchan próitéine an milléad agus an fhorshnáithín leis an Measúnacht BCA, laghdaíodh samplaí le 5 mM déthiothreitol (DTT; Sigma), ailcilíodh iad le 15 mM iaidéacéitimíd (Sigma) agus goradh iad ag 37 °C (1:0 50) ar feadh 1 uair an chloig le tripsiniú: cóimheas tripsin:substráit). Rinneadh RapiGest a scaoileadh trí 200 mM HCl a chur leis, agus ina dhiaidh sin goradh ag 37 °C ar feadh 45 nóiméad agus lártheifneoiriú ag 14,000 rpm ar feadh 10 nóiméad ag 4 °C chun smionagar a bhaint. Niteadh samplaí trí eastóscadh céim sholadaigh dé-mhód (cartúis Oasis MCX, Waters) agus athfhionraíodh iad i 0.1% aigéad formach le haghaidh tiúchan próitéine deiridh de 0.33 µg µl-1. Rinneadh anailís chomhchosúil ar phróitéóim MAG neamhlipéadaithe ó fhir mhaighdeana. Rinneadh anailís ar dhá mhacasamhlú anailíseach do gach sampla. Ansin, rinneadh anailís ar 1 µg de gach ceann acu ag baint úsáide as colún shilice comhleáite 25-cm 75-μm le Gaiste frite Kasil1 (PQ) shilice comhleáite 4 cm pacáilte le roisín céim-aisiompaithe Jupiter C12 (Phenomenex) agus crómatagrafaíocht leachtach 180 nóiméad. Díleá samplacha – Rinneadh MS/MS a rith ar speictriméadar maise Q-Exactive HF (Thermo Fisher) le Córas nanoACQUITY UPLC (Waters). Rinneadh sonraí fála a bhain leis na sonraí a gineadh do gach rith a thiontú go formáid mzML ag baint úsáide as Proteowizard (leagan 3.0.20287) agus ag baint úsáide as Comet31 (leagan 3.2) i gcoinne bhunachar sonraí FASTA ina bhfuil seichimh próitéine ó Anopheles gambiae (VectorBase leagan 54), Anopheles coluzzi. Rinneadh cuardach ar Mali-NIH (VectorBase leagan 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Márta 2021), A. gambiae RNA-seq, agus aistriúcháin trí fhráma ar thruailleáin dhaonna aitheanta. Cinneadh FDRanna meaitseáilte le léarscáil peiptíde ag baint úsáide as Percolator32 (leagan 3.05) le tairseach de 0.01, agus cuireadh peiptídí le chéile i sainaitheantais próitéine ag baint úsáide as parsimony próitéine i Limelight33 (leagan 2.2.0).Meastar líonmhaireacht choibhneasta próitéine ag baint úsáide as an bhfachtóir flúirse speictreach normalaithe (NSAF) a ríomhadh do gach próitéin i ngach rith mar a thuairiscíodh roimhe seo.Rinneadh meánú ar NSAF i gcoibhneas le gach próitéin thar shamplaí ó dhá mhacasamhlú bitheolaíocha éagsúla.Chuir lipéadú 15N an próitéóm baineann i bhfolach go rathúil, cé gur féidir méid beag próitéine neamhlipéadaithe a bhrath ó na maighdeana lipéadaithe.Thaifeadamar braiteadh laghdaithe próitéine fireann (speictream 1-5) i samplaí amha baineann i ritheanna teicniúla amháin, áit ar rith samplaí amha tar éis samplaí fireann/cúplála, mar thoradh ar “iompar anonn” HPLC.Tá próitéiní ócáideacha a fuarthas mar 'thruailleáin' ó mhaighdeana lipéadaithe liostaithe i dTábla Forlíontach 1.
Dhá pheiptíd antaigineacha, QTTDRVAPAPDQQQ (laistigh d'iseatóip PA) agus MESDGTTPSGDSEQ (laistigh d'iseatóip PA agus PB) i Genscript. Cuireadh an dá pheiptíd le chéile, ansin comhchuingíodh iad leis an bpróitéin iompróra KLH agus instealladh iad i gcoiníní na Nua-Shéalainne. Íobairtíodh na coiníní tar éis an cheathrú insteallta, agus leithlisíodh IgG iomlán trí íonú claonta. Baineadh úsáid as IgG ón gcoinín ba shainiúla do EPP le haghaidh tuilleadh blotála thiar.
I gcás blotanna thiar, cuireadh maolán eastósctha próitéine (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% dí-ocsaileáit sóidiam; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; cócteil coscaire próitéáis 1× (Roche)) leis ar leithligh. Rinneadh na samplaí a homaiginiú díreach tar éis dí-seiceadh le coirníní (coirníní gloine 2 mm, 2,400 rpm, 90 soic). Baineadh smionagar dothuaslagtha trí lártheifneoiriú ag 20,000 g ag 4 °C. Rinneadh cainníochtú ar na próitéiní trí mheasúnacht Bradford (Bio-Rad). Ansin, rinneadh 20 µg de phróitéin MAG, 40 µg de phróitéin LRT, agus 20 µg de phróitéin mórchóir iarmharach a dhínádúrú agus a dheighilt trí... 10% Bis-Tris NuPAGE ag baint úsáide as maolán MOPS. Aistríodh próitéiní chuig seicní fluairíde polaivinilídéine ag baint úsáide as an gcóras aistrithe iBlot2 (Thermo Fisher). Nigheadh ​​na seicní faoi dhó in 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 i PBS) agus ansin blocáladh iad i maolán blocála Odyssey (Li-Cor) ar feadh 1 uair ag 22°C. Croitheadh ​​na seicní thar oíche ag 4°C le hantashubstaint phríomhúil pholachlónach frith-EPP coinín saincheaptha (1:700 i maolán blocála) agus antashubstaint phríomhúil monachlónach frith-aictin francach MAC237 (Abeam; 1:4,000). Nigheadh ​​na seicní le PBS-T agus ansin goradh iad le hantashubstaintí tánaisteacha (frith-choinín asal 800CW agus frith-francach gabhar 680LT (Li-Cor), an dá cheann 1:20,000) i maolán blocála ina raibh 0.01% SDS agus 0.2% Tween -20 ar feadh 1 uair ag 22 °C. Niteadh na scannáin le PBS-T agus rinneadh íomháú díobh le scanóir Odyssey CLx. Bailíodh agus próiseáladh íomhánna in Image Studio (leagan 5.2). Níor braitheadh ​​banda sonrach a fhreagraíonn don isoform EPP-RA (82 kDa).
Rinneadh réigiúin chódaithe EPP (mar isoform AGAP002463-RB ina bhfuil fearann ​​fosfatáis histidíne, cuardach fearainn chaomhnaithe NCBI 34) agus EcK2 (AGAP002181) a chlónáil i bplasmaid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Tá na tosaitheoirí liostaithe i dTábla Sonraí Leathnaithe 2. Cuireadh ocht nascóir GS4 (i dteannta) isteach roimh an gclib 6xHis C-críochfoirt den tógáil pET-21a(+)-EcK2. Táirgeadh próitéiní athchuingeacha ag baint úsáide as imoibriú sintéise próitéine E. coli saor ó chealla NEBExpress (New England BioLabs). Rinneadh próitéiní athchuingeacha a íonú ag baint úsáide as colúin sníomha NEBExpress Ni (New England BioLabs). Táirgeadh próitéin rialaithe laghdaitheoir déhidreafóláite (DHFR) ag baint úsáide as teimpléad DNA ón Trealamh Sintéise Próitéine E. coli Saor ó Chealla NEBExpress. Stóráladh próitéiní i 50% gliocról i PBS ag -20 °C ar feadh suas le 3 mhí.
Rinneadh tomhas ar ghníomhaíocht fosfatáise EPP agus sleachta fíocháin ag baint úsáide as fosfáit 4-nítreafheinil (pNPP; Sigma-Aldrich). Bhí 25 mM Tris, 50 mM aigéad aicéiteach, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, agus 1 mM DTT sa mhaolán imoibrithe. Rinneadh an fíochán a homaiginiú sa mhaolán imoibrithe agus baineadh smionagar cille trí lártheifneoiriú. Cuir tús leis an imoibriú trí einsím nó sliocht fíocháin a chur le maolán imoibrithe ina raibh 2.5 mg ml-1 pNPP. Goradh an meascán imoibrithe ag teocht an tseomra sa dorchadas, agus rinneadh an méid pNP a tiontaíodh ó pNPP a chainníochtú tríd an ionsú a thomhas ag 405 nm ag amanna éagsúla.
Chun gníomhaíocht EcK in vitro a bhaint amach, goradh an próitéin le 0.2 mg 20E nó 3D20E i maolán 200 µl (pH 7.5) ina raibh 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP agus 10 mM MgCl2 ar feadh 2 uair ag 27 °C. Cuireadh stop leis an imoibriú trí 800 µl meatánóil a chur leis, ansin fuaraíodh é ag -20 °C ar feadh 1 uair an chloig, agus ansin lártheifneoiríodh é ag 20,000 g ar feadh 10 nóiméad ag 4 °C. Rinneadh anailís ar an bhforshnáithín ansin le HPLC-MS/MS. Chun na próitéiní a úsáideadh sa ghrúpa rialaithe a dhíghníomhachtú le teas, goradh na próitéiní i 50% gliocról i PBS ar feadh 20 nóiméad ag 95 °C.
Chun gníomhaíocht EPP in vitro a bhaint amach, rinneadh an próitéin a ghoradh le 3D20E22P (atá coibhéiseach leis an méid a fhaightear i 18 péire de MAG, íonaithe trí HPLC-MS/MS) i maolán 100 µl (pH 7.5) ina raibh 25 mM Tris, 50 mM aigéad aicéiteach, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, agus 1 mM DTT ar feadh 3 uair an chloig ag 27 °C. Cuireadh stop leis an imoibriú trí 400 µl meatánóil a chur leis agus fuaraíodh é ag -20 °C ar feadh 1 uair an chloig, ansin rinneadh lártheifneoiriú air ag 20,000 g ar feadh 10 nóiméad ag 4 °C. Rinneadh anailís ar an bhforshnáithín trí HPLC-MS/MS.
Rinneadh blúirí PCR le haghaidh EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) agus EcK2 (556 bp) a aimpliú ó cDNA ullmhaithe ó choirp mhoscítí measctha gan cheann. Rinneadh blúire PCR an rialaithe eGFP (495 bp) a aimpliú ón pCR2.1-eGFP a thuairiscíodh roimhe seo; Tá tosaitheoirí PCR liostaithe i dTábla Sonraí Leathnaithe 2. Cuireadh an blúire PCR isteach idir na tionscnóirí T7 inbhéartaithe ar an plasmid pL4440. Aisghabhadh tógálacha plasmid ó E. coli inniúil NEB 5-α (New England Biolabs) agus fíoraíodh iad trí sheicheamhú DNA roimh úsáid (féach Sonraí Forlíontacha 1 le haghaidh seicheamh ionsáithe). Baineadh úsáid as tosaitheoirí a mheaitseáladh leis an tionscnóir T7 (Tábla Sonraí Leathnaithe 2) chun an t-ionchur ón plasmid bunaithe ar pL4440 a aimpliú. Deimhníodh méid táirge PCR trí leictreafóiréis glóthach agaróise. Tras-scríobhadh dsRNA ó theimpléid PCR ag baint úsáide as an Megascript T7 Trascríbhneoireacht Kit (Thermo Fisher) agus íonaíodh é de réir threoracha an mhonaróra leis na modhnuithe a thuairiscíodh roimhe seo.
Chun instealladh dsRNA a dhéanamh, rinneadh 1,380 ng de dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) a instealladh ag tiúchan 10 ng nl-1 isteach i dtorax fireann nó baineann fásta (Nanoject III, Drummond) laistigh de 1 lá tar éis an éicloiscthe. Cinneadh leibhéil cnagadh géine i dtrí mhacasamhlú bitheolaíocha ar a laghad trí eastóscadh RNA, sintéis cDNA, agus RT-qPCR. Chun instealladh ecdysone a dhéanamh, rinneadh 0.13, 0.21, nó 0.63 µg de 20E nó 3D20E (Nanoject III, Drummond) a instealladh ag tiúchain 1.3, 2.1, faoi seach, ag brath ar an dearadh turgnamhach nó 6.3 ng nl-1 i mbaineannaigh mhaighdean 4 lá d'aois nó 6 lá d'aois a raibh beathaithe leo le fuil. Instealladh 100 nl d'eatánól 10% (toirte/toirte) in uisce; 100 nl de 3D20E22P in eatánól 10% (arb ionann é agus 75% den mhéid a fhaightear i bpéire MAGanna). Sannadh mosquitos go randamach don ghrúpa insteallta.
I gcás tástálacha sceite, beathaíodh baineannaigh 3 lá d'aois ad libitum ar fhuil dhaonna. Baineadh moscítí a bhí beathaithe go páirteach nó nach raibh beathaithe. Ag brath ar an gcóireáil, cuireadh baineannaigh i gcupáin sceite ar leithligh ar feadh ceithre oíche ar a laghad 48 uair an chloig tar éis an bhéile fola. Rinneadh na huibheacha a chomhaireamh faoi steiréascóp (Stemi 508, Zeiss); i gcás baineannaigh cúpláilte, measadh go raibh uibheacha a gor ina larbhaí torthúil.
I gcás trialacha cúplála, tugadh dhá lá ar a laghad do na baineannaigh, ag brath ar an gcóireáil, chun friotaíocht i gcoinne cúplála a fhorbairt, agus tugadh fireannaigh fhiáine den aois chéanna isteach sa chliabhán céanna ina dhiaidh sin. Dhá oíche ina dhiaidh sin, rinneadh na veicilí toirchithe baineannaigh a dhíscaoileadh agus scaoileadh DNA géanómach trí reo-leá agus sonication i maolán ina raibh 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, agus 25 mM NaCl (pH 8.2). Goradh na samplaí le Proteinase K (0.86 µg µl-1) ar feadh 15 nóiméad ag 55 °C, agus ina dhiaidh sin 10 nóiméad ag 95 °C. Caolaíodh ullmhóidí DNA géanómach amh 10 n-uaire agus rinneadh braiteadh qPCR orthu ar sheichimh crómasóim Y; tá na tosaitheoirí liostaithe i dTábla Sonraí Leathnaithe 2. Léiríonn easpa seicheamh crómasóim Y nach raibh aon chúpláil ann.
I gcás aistí athchúrlála, rinneadh scrúdú ar bhaineannaigh a ndearnadh fórsa cúplála orthu le haghaidh láithreacht plocóidí cúplála chun a stádas cúplála a dhearbhú agus tugadh 2 lá dóibh chun athfhriotaíocht a fhorbairt i leith cúplála in éagmais fireannaigh, mar a thuairiscíodh roimhe seo36. Tugadh fireannaigh a raibh speirm thrasghéineach DsRed iontu isteach i gcaighean baineann ansin. Dhá oíche ina dhiaidh sin, díscaoileadh na veicilí toirchithe ó na baineannaigh, agus ullmhaíodh DNA géanómach mar a thuairiscítear thuas agus rinneadh braiteadh qPCR den thrasghéin DsRed air; tá na tosaitheoirí liostaithe i dTábla Sonraí Leathnaithe 2. Léirigh easpa an thrasghéin DsRed nár tharla aon athchúráil.
Sintéiseadh 3D20E mar a thuairiscíodh roimhe seo 37. Go hachomair, tuaslagadh 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) i 10 ml d'uisce, agus ina dhiaidh sin cuireadh 30 mg de phlatanam dubh (i bhfoirm púdair, Sigma-Aldrich) leis. Cuireadh sruth mín O2 isteach sa mheascán imoibrithe go leanúnach, a corraíodh ag teocht an tseomra. Tar éis 6 uair an chloig, cuireadh 30 mL de meatánól leis chun an t-imoibriú a stopadh. Lártheifneoiríodh an meascán chun cáithníní catalaíoch a bhaint. Galaíodh an forshnáithín go dtí go raibh sé tirim i bhfolús ag teocht an tseomra. Tuaslagadh an táirge imoibrithe triomaithe in eatánól 10% agus meatánól le haghaidh insteallta le haghaidh anailíse HPLC-MS/MS. Bhí an ráta comhshó (ó 20E go 3D20E) thart ar 97% (Fíor 4b), agus bhí speictream MS an 3D20E sintéisithe ag teacht leis an gceann a fuarthas i mbaineannaigh cúpláilte (Fíor 4c).
Tá sonraí sonracha faoi na tástálacha staitistiúla a rinneadh sa finscéal. Baineadh úsáid as GraphPad (leagan 9.0) chun tástáil chruinn Fisher, tástáil Mantel-Cox, agus tástáil-t an Mhic Léinn a dhéanamh. Rinneadh tástálacha Cochran-Mantel-Haenszel ag baint úsáide as script R saincheaptha (ar fáil ag https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Rinneadh tástáil ar an dáileadh sonraí le haghaidh gnáthachta ag baint úsáide as tástáil Shapiro-Wilk le tairseach suntasachta de 0.05. Nuair a theip ar na sonraí sa tástáil gnáthachta, rinneadh tástáil Mann-Whitney. Rinneadh anailís ar shonraí marthanais ag baint úsáide as tástáil Mantel-Cox. Baineadh úsáid as an bpacáiste DESeq2 (leagan 1.28.1) chun anailís difreálach ar léiriú géine RNA-seq a dhéanamh. Léiríonn an barra cothrománach ar an ngraf an meán. Baineadh úsáid as luach suntasachta de P = 0.05 mar an tairseach do na tástálacha uile.
Le haghaidh tuilleadh eolais faoi dhearadh an staidéir, féach achoimre ar an Nature Research Report atá nasctha leis an alt seo.
Taisceadh sonraí próitéómacha MS i gComhdháil ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) tríd an PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) leis an aitheantóir tacair sonraí PXD032157.
Tá an tacar sonraí RNA-seq taiscthe sa Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) faoin taifead sraitheach GSE198665.
Is féidir tacair sonraí breise a gineadh agus/nó a ndearnadh anailís orthu le linn an staidéir reatha a fháil ó na húdair chomhfhreagracha ar iarratas réasúnta. Soláthraíonn an t-alt seo na sonraí foinseacha.
De Loof, A. Eicdisteroidí: Stéaróidigh ghnéis feithidí faillithe? Fireann: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hiodrocsai-eicdisón agus forbairt ubhagánach in Anopheles stephens. J. Fiseolaíocht Insect. 28, 97–109 (1982).