Is gné lárnach den mhicri-thimpeallacht meall (TME) iad meitibilítí imdhíonmhodhnúcháin, ach seachas cúpla eisceacht, níl a gcéannacht den chuid is mó ar eolas. Anseo, rinneamar anailís ar meall agus ar chealla T ó mheall agus ascites othar a raibh carcanama serónach ardghráid (HGSC) orthu chun meitibileam na n-urrann TME éagsúla seo a nochtadh. Tá difríochtaí fairsinge meitibilítí idir ascites agus cealla meall. I gcomparáid le haiscítí, tá na cealla T a ionraíonn meall saibhrithe go suntasach i 1-meitilnicotinamide (MNA). Cé go bhfuil leibhéal MNA i gcealla T ardaithe, tá léiriú N-meitiltransferase nicotinamide (einsím a chatalaíonn aistriú grúpaí meitile ó S-adenosylmethionine go nicotinamide) teoranta do fibroblasts agus cealla meall. Go feidhmiúil, spreagann MNA cealla T chun an cítocín fachtóir néacróis meall alfa a scaoileadh a chuireann meall chun cinn. Dá bhrí sin, cuireann MNA díorthaithe ó TME le rialáil imdhíonachta cealla T agus is sprioc imdhíoneolaíochta ionchasach é chun ailse dhaonna a chóireáil.
Is féidir le meitibilítí díorthaithe ó meall éifeacht choscach dhomhain a bheith acu ar dhíolúine frith-meall, agus léiríonn níos mó agus níos mó fianaise gur féidir leo feidhmiú mar phríomhfhórsa tiomána do dhul chun cinn galair (1). Chomh maith le héifeacht Warburg, tá tús curtha le hobair le déanaí chun staid meitibileach cealla meall agus a ghaol le staid imdhíonachta mhicri-thimpeallacht an meall (TME) a ​​shainiú. Léirigh staidéir ar mhúnlaí lucha agus ar chealla T daonna gur féidir le meitibileacht glútamíne (2), meitibileacht ocsaídiúcháin (3) agus meitibileacht glúcóis (4) gníomhú go neamhspleách ar fhoghrúpaí éagsúla cealla imdhíonachta. Cuireann roinnt meitibilítí sna conairí seo cosc ​​ar fheidhm frith-meall cealla T. Tá sé cruthaithe gur féidir le bac a chur ar an gcomheinsím teitreahidreabiopterin (BH4) dochar a dhéanamh d'iomadú cealla T, agus gur féidir le méadú BH4 sa chorp an freagairt imdhíonachta frith-meall a idirghabhálann CD4 agus CD8 a fheabhsú. Ina theannta sin, is féidir éifeacht imdhíon-chosc kynurenine a tharrtháil trí riarachán BH4 (5). I nglioblastóma sóchánach isocitrate dehydrogenase (IDH), cuireann secretion enantiometabolic (R)-2-hydroxyglútaráit (R-2-HG) bac ar ghníomhachtú, iomadú agus gníomhaíocht cítealaithe cealla T (6). Le déanaí, léiríodh go dtáirgeann cealla coisctheacha de bhunadh myeloid meitilglioxal, fotháirge de ghlúcólú, agus gur féidir le haistriú cealla T meitilglioxal feidhm cealla T éifeachtóra a chosc. I gcóireáil, is féidir le neodrú meitilglioxal dul thar ghníomhaíocht cealla coisctheacha díorthaithe ó myeloid (MDSC) agus teiripe blocála seicphointe a fheabhsú go sineirgisteach i samhlacha lucha (7). Leagann na staidéir seo béim le chéile ar ról lárnach meitibilítí díorthaithe ó TME i rialáil feidhm agus gníomhaíochta cealla T.
Tuairiscíodh go forleathan mífheidhm chealla T i gcás ailse ubhagáin (8). Tá sé seo mar gheall go páirteach ar na tréithe meitibileach atá i gceist le hipocsa agus soithíocht neamhghnácha meall (9), rud a fhágann go ndéantar glúcós agus tryptophan a thiontú ina bhfotháirgí ar nós aigéad lachtach agus cinúiréinín. Laghdaíonn lachtáit eachtarcheallach iomarcach táirgeadh interferon-γ (IFN-γ) agus spreagann sé difreáil foghrúpaí mielosuppressive (10, 11). Cuireann tomhaltas tryptophan cosc ​​​​díreach ar iomadú cealla T agus cuireann sé cosc ​​​​ar chomharthaíocht gabhdóirí cealla T (12-14). In ainneoin na mbreathnuithe seo, rinneadh go leor oibre maidir le meitibileacht imdhíonachta i gcultúr cealla T in vitro ag baint úsáide as meáin optamaithe, nó teoranta do mhúnlaí lucha homalógacha in vivo, agus ní léiríonn ceachtar acu go hiomlán éagsúlacht ailse daonna agus an timpeallacht mhacra agus micrea fiseolaíoch.
Gné choitianta d’ailse ubhagáin is ea scaipeadh peritoneal agus cuma ascites. Tá carnadh sreabhán cille in ascites bainteach le galar chun cinn agus drochphrognóis (15). De réir tuairiscí, tá an urrann uathúil seo hipocsach, tá leibhéil arda fachtóir fáis endothelial soithíoch (VEGF) agus indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) ann, agus tá cealla rialála T agus cealla coisctheacha myeloid ag dul isteach ann (15-18). D’fhéadfadh timpeallacht meitibileach ascites a bheith difriúil ó thimpeallacht an meall féin, mar sin níl athchlárú cealla T sa spás peritoneal soiléir. Ina theannta sin, d’fhéadfadh na príomhdhifríochtaí agus an éagsúlacht idir ascites agus meitibilítí atá i láthair i dtimpeallacht an meall bac a chur ar insíothlú cealla imdhíonachta agus a bhfeidhm ar meall, agus tá gá le tuilleadh taighde.
Chun na fadhbanna seo a réiteach, dhearamar modh scaradh cealla íogair agus mais-speictriméadracht tandem crómatagrafaíochta leachta (LC-MS/MS) chun cineálacha éagsúla cealla (lena n-áirítear cealla T CD4+ agus CD8+) a staidéar chomh maith le laistigh de meall agus idir siadaí. Clúdaíonn a meitibilítí cealla san ascites agus timpeallacht meall chéanna den othar. Úsáidimid an modh seo i gcomhar le cítiméadracht sreafa ardtoiseach agus seicheamhú RNA aoncheallach (scRNA-seq) chun portráid ard-réitigh a sholáthar de stádas meitibileach na bpríomhdhaonraí seo. Léirigh an modh seo méadú suntasach ar leibhéal 1-meitilnicotinamide (MNA) i gcealla T meall, agus léirigh turgnaimh in vitro nach raibh éifeacht imdhíonmhodhnúcháin MNA ar fheidhm cealla T ar eolas roimhe seo. Go ginearálta, nochtann an modh seo na hidirghníomhaíochtaí meitibileach frithpháirteach idir meall agus cealla imdhíonachta, agus soláthraíonn sé léargas uathúil ar mheitibilítí rialála imdhíonachta, a d'fhéadfadh a bheith úsáideach le haghaidh cóireáil imdhíon-theiripe ailse ubhagáin bunaithe ar chealla T. Deiseanna cóireála.
Bhaineamar úsáid as citiméadracht shreabhadh ardtoiseach chun glacadh glúcóis [2-(N-(7-nítreafheinil-2-ocsa-1,3-diaza-4-il)aimín)-2-deocsaiglúcós (2-NBDG) agus gníomhaíocht mitochondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) a chainníochtú ag an am céanna. Is marcóirí tipiciúla taobh le taobh iad a dhéanann idirdhealú idir cealla imdhíonachta agus daonraí cealla meall (Tábla S2 agus Fíor S1A). Léirigh an anailís seo, i gcomparáid le cealla T, go bhfuil leibhéil glactha glúcóis níos airde ag cealla ascites agus meall, ach go bhfuil difríochtaí níos lú acu i ngníomhaíocht mitochondrial. Tá meánghlacadh glúcóis cealla meall [CD45-EpCAM (EpCAM)+] trí nó ceithre huaire níos mó ná cealla T, agus tá meánghlacadh glúcóis cealla T CD4+ 1.2 uair níos mó ná cealla T CD8+, rud a léiríonn go bhfuil riachtanais mheitibileacha difriúla ag limficítí insíothlaithe meall (TIL) fiú san TME céanna (Fíor 1A). I gcodarsnacht leis sin, tá an ghníomhaíocht mitochondrial i gcealla meall cosúil le gníomhaíocht cealla T CD4+, agus tá gníomhaíocht mitochondrial an dá chineál cealla níos airde ná gníomhaíocht cealla T CD8+ (Fíor 1B). Go ginearálta, léiríonn na torthaí seo an leibhéal meitibileach. Tá gníomhaíocht meitibileach cealla meall níos airde ná gníomhaíocht cealla T CD4+, agus tá gníomhaíocht meitibileach cealla T CD4+ níos airde ná gníomhaíocht cealla T CD8+. In ainneoin na n-éifeachtaí seo trasna cineálacha cealla, níl aon difríocht chomhsheasmhach i stádas meitibileach cealla T CD4+ agus CD8+ ná ina gcionmhaireachtaí coibhneasta in ascites i gcomparáid le meall (Fíor 1C). I gcodarsnacht leis sin, sa chodán cealla CD45, mhéadaigh cion na gcealla EpCAM+ sa meall i gcomparáid le ascites (Fíor 1D). Thugamar faoi deara freisin difríocht meitibileach shoiléir idir comhpháirteanna cealla EpCAM+ agus EpCAM-. Tá iontógáil glúcóis agus gníomhaíocht mitochondrial níos airde ag cealla EpCAM+ (meall) ná cealla EpCAM-, atá i bhfad níos airde ná gníomhaíocht meitibileach fibroblasts i gcealla meall i TME (Fíor 1, E agus F).
(A agus B) Déine fhluaraiseachta mheánach (MFI) iontógáil glúcóis (2-NBDG) (A) agus gníomhaíocht mitochondrial cealla T CD4 + (MitoTracker dearg dorcha) (B) Graif ionadaíocha (ar chlé) agus sonraí táblaithe (ar dheis), cealla T CD8 + agus cealla EpCAM + CD45-meall ó ascites agus meall. (C) Cóimheas cealla CD4 + agus CD8 + (de chealla T CD3 +) in ascites agus meall. (D) Cion de chealla meall EpCAM + in ascites agus meall (CD45−). (E agus F) Iontógáil glúcóis EpCAM + CD45-meall agus EpCAM-CD45-maitrís (2-NBDG) (E) agus gníomhaíocht mitochondrial (MitoTracker dearg dorcha) (F) graif ionadaíocha (ar chlé) agus sonraí táblaithe (ar dheis) Ascites agus cealla meall. (G) Graif ionadaíocha de léiriú CD25, CD137 agus PD1 trí chíteiméadracht sreafa. (H agus I) Léiriú CD25, CD137 agus PD1 ar chealla T CD4+ (H) agus cealla T CD8+ (I). (J agus K) Feinitíopaí cuimhne naive, lárnaigh (Tcm), éifeachtóra (Teff) agus éifeachtóra (Tem) bunaithe ar léiriú CCR7 agus CD45RO. Íomhánna ionadaíocha (ar chlé) agus sonraí táblacha (ar dheis) de chealla T CD4+ (J) agus cealla T CD8+ (K) in ascites agus meall. Luachanna P cinntithe trí thástáil t péireáilte (*P<0.05, **P<0.01 agus ***P<0.001). Léiríonn an líne othair mheaitseáilte (n = 6). FMO, fluaraiseacht lúide a haon; MFI, déine fluaraiseachta meánach.
Léirigh anailís bhreise difríochtaí suntasacha eile idir stádas feinitíopach na gcealla T ard-réitithe. Is minice a bhíonn an chuimhne ghníomhachtaithe (Fíor 1, G go I) agus an chuimhne éifeachtóra (Fíor 1, J agus K) i meall ná ascites (cion na gcealla T CD3+). Ar an gcaoi chéanna, léirigh anailís ar an bhfeinitíopa trí léiriú marcóirí gníomhachtaithe (CD25 agus CD137) agus marcóirí ídithe [próitéin báis cille cláraithe 1 (PD1)], cé go bhfuil tréithe meitibileacha na ndaonraí seo difriúil (Fíor S1, B go E), níor breathnaíodh aon difríochtaí meitibileacha suntasacha go comhsheasmhach idir fo-thacair naive, éifeachtóra nó cuimhne (Fíor S1, F go I). Deimhníodh na torthaí seo trí mhodhanna foghlama meaisín a úsáid chun feinitíopaí cille a shannadh go huathoibríoch (21), rud a léirigh tuilleadh láithreacht líon mór cealla smior cnámh (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) in ascites an othair (Fíor S2A). I measc na gcineálacha cealla uile a sainaithníodh, léirigh an daonra cealla myeloid seo an glacadh glúcóis agus an ghníomhaíocht mitochondrial is airde (Fíor S2, B go G). Leagann na torthaí seo béim ar na difríochtaí meitibileacha láidre idir na cineálacha cealla iolracha a fhaightear in ascites agus meall in othair HGSC.
Is é an príomhdhúshlán maidir le saintréithe meitibileatómacha TIL a thuiscint ná an gá atá le samplaí cealla T a bhfuil íonacht, cáilíocht agus cainníocht leordhóthanach iontu a leithlisiú ó meall. Léirigh staidéir le déanaí gur féidir le modhanna sórtála agus saibhrithe coirníní bunaithe ar chitiméadracht sreafa athruithe a dhéanamh ar phróifílí meitibilítí ceallacha (22-24). Chun an fhadhb seo a shárú, rinneamar an modh saibhrithe coirníní a bharrfheabhsú chun TIL a leithlisiú agus a aonrú ó ailse ubhagánach daonna a ndearnadh obráid uirthi roimh anailís le LC-MS/MS (féach Ábhair agus Modhanna; Fíor 2A). Chun tionchar foriomlán an phrótacail seo ar athruithe meitibilítí a mheas, rinneamar comparáid idir próifílí meitibilítí na gcealla T a ghníomhaigh deontóirí sláintiúla tar éis na céime scaradh coirníní thuas le cealla nár scaradh le coirníní ach a d'fhan ar oighear. Fuair ​​an anailís rialaithe cáilíochta seo go bhfuil comhghaol ard idir an dá choinníoll seo (r = 0.77), agus go bhfuil inathdhéantacht ard ag inathdhéantacht theicniúil an ghrúpa de 86 meitibilít (Fíor 2B). Dá bhrí sin, is féidir leis na modhanna seo anailís chruinn meitibilítí a dhéanamh i gcealla atá ag dul faoi shaibhriú cineál cealla, rud a sholáthraíonn an chéad ardán ardtaifigh chun meitibilítí sonracha i HGSC a aithint, rud a chuireann ar chumas daoine tuiscint níos doimhne a fháil ar shonrúlacht cille sa chlár meitibileachta gnéis.
(A) Léaráid sceitseach de shaibhriú coirníní maighnéadacha. Roimh anailís le LC-MS/MS, déanfar trí bhabhta as a chéile de shaibhriú coirníní maighnéadacha ar na cealla nó fanfaidh siad ar oighear. (B) Éifeacht an chineáil shaibhrithe ar líonmhaireacht na meitibilítí. Meán na dtrí thomhas do gach cineál saibhrithe ± SE. Léiríonn an líne liath caidreamh 1:1. An comhghaol intreach-aicme (ICC) de thomhais athchleachtacha a thaispeántar sa lipéad ais. NAD, dinucleotide adenine nicotinamide. (C) Léaráid sceitseach de shreabhadh oibre anailíse meitibilítí othar. Bailítear ascites nó meall ó othair agus crió-chaomhnaítear iad. Rinneadh anailís ar chuid bheag de gach sampla le cítiméadracht sreafa, agus rinneadh trí bhabhta saibhrithe ar na samplaí eile do chealla CD4+, CD8+ agus CD45-. Rinneadh anailís ar na codáin chealla seo ag baint úsáide as LC-MS/MS. (D) Léarscáil teasa de líonmhaireacht meitibilítí caighdeánaithe. Léiríonn an deindragram braisliú Ward ar achair Eoiclídeacha idir samplaí. (E) Anailís phríomhchodanna (PCA) ar léarscáil meitibilít an tsampla, ag taispeáint trí mhacasamhlú de gach sampla, samplaí ón othar céanna ceangailte le líne. (F) PCA phróifíl meitibilít an tsampla coinníollaithe ar an othar (i.e., ag baint úsáide as iomarcaíocht pháirteach); tá an cineál sampla teoranta ag an gcabhail dronnach. PC1, príomhchodán 1; PC2, príomhchodán 2.
Ansin, chuireamar an modh saibhrithe seo i bhfeidhm chun 99 meitibilít a anailísiú sna codáin cealla CD4+, CD8+ agus CD45 sna príomh-ascites agus meall i sé othar HGSC (Fíor 2C, Fíor S3A agus Tábla S3 agus S4). Is ionann an daonra spéise agus 2% go 70% den sampla mór bunaidh de chealla beo, agus athraíonn cion na gcealla go mór idir othair. Tar éis na coirníní a dheighilt, is ionann an codán saibhrithe spéise (CD4+, CD8+ nó CD45-) agus níos mó ná 85% de na cealla beo go léir sa sampla ar an meán. Ligeann an modh saibhrithe seo dúinn daonraí cealla a anailísiú ó mheitibileacht fíochán meall daonna, rud nach féidir a dhéanamh ó shamplaí móra. Ag baint úsáide as an bprótacal seo, chinneamar go raibh l-cinurenine agus adenosine, an dá mheitibilít imdhíon-chosctha seo atá tréithrithe go maith, ardaithe i gcealla T meall nó i gcealla meall (Fíor S3, B agus C). Dá bhrí sin, léiríonn na torthaí seo dílseacht agus cumas ár dteicneolaíochta deighilte cealla agus mais-speictriméadrachta chun meitibilítí tábhachtacha ó thaobh na bitheolaíochta de a aimsiú i bhfíocháin othar.
Léirigh ár n-anailís freisin go raibh deighilt meitibileach láidir idir cineálacha cealla laistigh d'othair agus idir othair (Fíor 2D agus Fíor S4A). Go háirithe, i gcomparáid le hothair eile, léirigh othar 70 tréithe meitibileach éagsúla (Fíor 2E agus Fíor S4B), rud a léiríonn go bhféadfadh éagsúlacht mhór meitibileach a bheith idir othair. Is fiú a thabhairt faoi deara, i gcomparáid le hothair eile (1.2 go 2 lítear; Tábla S1), go raibh an méid iomlán ascites a bailíodh in othar 70 (80 ml) níos lú. Taispeánann rialú na héagsúlachta idir othair le linn anailíse príomhchodanna (mar shampla, ag baint úsáide as anailís iomarcaíochta páirteach) athruithe comhsheasmhacha idir cineálacha cealla, agus tá na cineálacha cealla agus/nó an micri-thimpeallacht comhiomlánaithe go soiléir de réir phróifíl an mheitibileitíobáit (Fíor 2F). Leag anailís ar mheitibilítí aonair béim ar na héifeachtaí seo agus léirigh sí difríochtaí suntasacha idir cineálacha cealla agus micri-thimpeallacht. Is fiú a thabhairt faoi deara gurb é an difríocht is mó a breathnaíodh ná MNA, atá saibhrithe de ghnáth i gcealla CD45- agus i gcealla CD4+ agus CD8+ a insíothlaíonn an meall (Fíor 3A). I gcás cealla CD4+, is léir an éifeacht seo, agus is cosúil go bhfuil tionchar mór ag an timpeallacht ar an MNA i gcealla CD8+ freisin. Mar sin féin, níl sé seo tábhachtach, mar ní féidir ach triúr as na sé othar a mheasúnú le haghaidh scóir CD8+ meall. Chomh maith le MNA, i gcineálacha éagsúla cealla in ascites agus meall, tá meitibilítí eile atá tréithrithe go dona i TIL saibhir go difriúil freisin (Fíoracha S3 agus S4). Dá bhrí sin, léiríonn na sonraí seo sraith gheallmhar meitibilítí imdhíonmhodhnúcháin le haghaidh tuilleadh taighde.
(A) Ábhar normalaithe MNA i gcealla CD4+, CD8+ agus CD45- ó ascites agus meall. Taispeánann an plota bosca an meán (líne), an raon idircheathrúnach (insí fráma) agus an raon sonraí, suas le 1.5 oiread an raoin idircheathrúnach (siúc fráma). Mar a thuairiscítear in Ábhair agus Modhanna Othar, bain úsáid as luach limma an othair chun an luach P (*P<0.05 agus **P<0.01) a chinneadh. (B) Léaráid sceimteach de mheitibileacht MNA (60). Meitibilítí: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, mononucleotide nicotinamide. Einsímí (glas): NNMT, nicitínaimíd N-meitiltrasfairéas; SIRT, sirtuiní; NAMPT, nicitínaimíd fosfaribosail trasfairéas; AOX1, ocsaídáis aldehyde 1; NRK, cíneas ribosíde nicitínaimíd; NMNAT, mona-nicitínaimíd adenylate trasfairéas; Pnp1, fosfarailéas núicléasíde púirín. (C) t-SNE de scRNA-seq ascites (liath) agus meall (dearg; n = 3 othar). (D) Léiriú NNMT i ndaonraí cealla éagsúla a sainaithníodh ag baint úsáide as scRNA-seq. (E) Léiriú NNMT agus AOX1 i gcealla T SK-OV-3, duáin shuthacha daonna (HEK) 293T, agus cealla T cóireáilte le MNA. Taispeántar an léiriú fillte i gcoibhneas le SK-OV-3. Taispeántar an patrún léirithe le SEM (n = 6 deontóir sláintiúil). Meastar nach féidir luachanna Ct níos mó ná 35 a bhrath (UD). (F) Léiriú SLC22A1 agus SLC22A2 i gcealla T SK-OV-3, HEK293T agus cealla T ar tugadh 8mM MNA dóibh. Taispeántar an léiriú fillte i gcoibhneas le SK-OV-3. Taispeántar patrún an léirithe le SEM (n = 6 deontóir sláintiúil). Meastar nach féidir luachanna Ct níos mó ná 35 a bhrath (UD). (G) Ábhar MNA cille i gcealla T deontóra sláintiúla gníomhachtaithe tar éis 72 uair an chloig goradáin le MNA. Taispeántar patrún an léirithe le SEM (n = 4 deontóir sláintiúil).
Déantar MNA a tháirgeadh tríd an ngrúpa meitile a aistriú ó S-adenosyl-1-methionine (SAM) go nicotinamide (NA) trí nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Fíor 3B). Déantar ró-léiriú ar NNMT i réimse ailse daonna agus tá baint aige le iomadú, ionradh agus meiteastáis (25-27). Chun foinse MNA i gcealla T i TME a thuiscint níos fearr, d'úsáideamar scRNA-seq chun léiriú NNMT a shainiú trasna cineálacha cealla in ascites agus meall trí othar HGSC (Tábla S5). Léirigh anailís ar thart ar 6,500 cealla go raibh léiriú NNMT srianta i dtimpeallachtaí ascites agus meall do na daonraí cealla fibroblast agus meall a bhí ceaptha a bheith iontu (Fíor 3, C agus D). Is fiú a thabhairt faoi deara nach bhfuil aon léiriú NNMT soiléir in aon daonra a léiríonn PTPRC (CD45 +) (Fíor 3D agus Fíor S5A), rud a léiríonn gur tugadh isteach an MNA a braitheadh ​​sa speictream meitibilíte i gcealla T. Déanann léiriú ocsaídáis aldehyde 1 (AOX1) MNA a thiontú ina 1-meitil-2-piridón-5-carboxaimíd (2-PYR) nó ina 1-meitil-4-piridón-5-carboxaimíd (4-PYR); tá Fíor 3B) srianta freisin don daonra fibroblasts a léiríonn COL1A1 (Fíor S5A), rud a léiríonn le chéile nach bhfuil cumas meitibileachta MNA traidisiúnta ag cealla T. Fíoraíodh patrún léirithe na ngéinte seo a bhaineann le MNA ag baint úsáide as an dara sraith sonraí cealla neamhspleách ó ascites ó othair HGSC (Fíor S5B; n = 6) (16). Ina theannta sin, léirigh anailís chainníochtúil imoibriú slabhrúil polaiméaráise (qPCR) ar chealla T deontóra sláintiúla a ndearnadh cóireáil orthu le MNA, i gcomparáid le cealla meall ubhagánacha rialaithe SK-OV-3, nach raibh NNMT ná AOX1 beagnach léirithe (Fíor 3E). Léiríonn na torthaí gan choinne seo gur féidir MNA a scaoileadh ó fibroblasts nó meall isteach i gcealla T cóngaracha i TME.
Cé go n-áirítear leis na hiarrthóirí teaghlach na n-iompróirí catóin orgánacha 1 go 3 (OCT1, OCT2 agus OCT3) atá ionchódaithe ag an teaghlach iompróra intuaslagtha 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 agus SLC22A3), níl iompróirí féideartha MNA sainmhínithe fós (28). Léirigh QPCR mRNA ó chealla T deontóra sláintiúla leibhéil ísle léirithe SLC22A1 ach leibhéil dobhraite SLC22A2, rud a dheimhnigh gur tuairiscíodh é roimhe seo sa litríocht (Fíor 3F) (29). I gcodarsnacht leis sin, léirigh an líne cille meall ubhagánach SK-OV-3 leibhéil arda den dá iompróir (Fíor 3F).
Chun tástáil a dhéanamh ar an bhféidearthacht go mbeadh cumas ag cealla T MNA coigríche a ionsú, saothraíodh cealla T deontóra sláintiúla ar feadh 72 uair an chloig i láthair tiúchain éagsúla MNA. In éagmais MNA eisgéineach, ní féidir ábhar ceallach MNA a bhrath (Fíor 3G). Mar sin féin, léirigh cealla T gníomhachtaithe a ndearnadh cóireáil orthu le MNA eisgéineach méadú dáileog-spleách ar ábhar MNA sna cealla, suas le 6 mM MNA (Fíor 3G). Léiríonn an toradh seo, in ainneoin an leibhéal íseal léirithe iompróra agus easpa an phríomheinsím atá freagrach as meitibileacht incheallach MNA, gur féidir le TIL MNA a ionsú fós.
Méadaíonn speictream na meitibilítí i gcealla T na n-othar agus turgnaimh ionsúcháin MNA in vitro an fhéidearthacht go scaoileann fibroblasts a bhaineann le hailse (CAF) MNA agus go bhféadfadh cealla meall feinitíopa agus feidhm TIL a rialáil. Chun éifeacht MNA ar chealla T a chinneadh, gníomhaíodh cealla T deontóra sláintiúla in vitro i láthair nó as láthair MNA, agus rinneadh meastóireacht ar a n-iomadú agus a dtáirgeadh cytokine. Tar éis 7 lá de MNA a chur leis ag an dáileog is airde, laghdaíodh líon dúbailte an daonra go measartha, agus coinníodh fuinneamh ag gach dáileog (Fíor 4A). Ina theannta sin, mar thoradh ar chóireáil MNA eisigineach, tháinig méadú ar chion na gcealla T CD4 + agus CD8 + a léirigh fachtóir néacróis meall-α (TNFα; Fíor 4B). I gcodarsnacht leis sin, laghdaíodh táirgeadh intracellular IFN-γ go suntasach i gcealla T CD4 +, ach ní i gcealla T CD8 +, agus ní raibh aon athrú suntasach in interleukin 2 (IL-2; Fíor 4, C agus D). Dá bhrí sin, léirigh measúnacht imdhíon-ionsúiteach einsím-nasctha (ELISA) ar fhorshnáithíní ó na cultúir chealla T seo ar tugadh MNA dóibh méadú suntasach ar TNFα, laghdú ar IFN-γ, agus gan aon athrú ar IL-2 (Fíor 4, E go G). . Léiríonn an laghdú ar IFN-γ go bhféadfadh ról a bheith ag MNA i gcosc a chur ar ghníomhaíocht fhrith-meall cealla T. Chun éifeacht MNA ar chíteatocsaineacht idirghabhála cealla T a insamhladh, déantar cealla gabhdóra antaigin chiméireach T (FRα-CAR-T) atá dírithe ar ghabhdóir fólait α agus cealla CAR-T (GFP) atá rialaithe ag próitéin fluaraiseach glas (GFP) -CAR-T) a tháirgeadh ag cealla monanúicléacha fola imeallacha deontóra sláintiúla (PBMC). Saothraíodh cealla CAR-T ar feadh 24 uair an chloig i láthair MNA, agus ansin comh-shaothraíodh iad le cealla meall ubhagánacha daonna SK-OV-3 a léiríonn gabhdóir fólait α ag cóimheas éifeachtóra le sprioc de 10:1. Mar thoradh ar chóireáil MNA, tháinig laghdú suntasach ar ghníomhaíocht mharú cealla FRα-CAR-T, rud a bhí cosúil le cealla FRα-CAR-T a ndearnadh cóireáil orthu le hadenosine (Fíor 4H).
(A) Líon iomlán na gceall inmharthana agus dúbailt an daonra (PD) go díreach ón gcultúr ar lá 7. Léiríonn an graf barra meán + SEM sé dheontóir shláintiúil. Léiríonn sé sonraí ó n = 3 thurgnamh neamhspleácha ar a laghad. (B go D) Baineadh úsáid as CD3/CD28 agus IL-2 chun cealla T a ghníomhachtú ag a dtiúchain MNA faoi seach ar feadh 7 lá. Roimh an anailís, spreagadh cealla le PMA/ionomycin le GolgiStop ar feadh 4 huaire an chloig. Léiriú TNFα (B) i gcealla T. Íomhá shamplach (ar chlé) agus sonraí táblacha (ar dheis) de léiriú TNFα i gcealla beo. Léiriú IFN-γ (C) agus IL-2 (D) i gcealla T. Tomhaiseadh léiriú cítocíní trí chitiméadracht sreafa. Léiríonn an graf barra an meán (n = 6 dheontóir shláintiúil) + SEM. Bain úsáid as anailís aontreo ar athraitheas agus tomhais arís agus arís eile (*P<0.05 agus **P<0.01) chun an luach P a chinneadh. Léiríonn sé sonraí ó n = 3 thurgnamh neamhspleácha ar a laghad. (E go G) Baineadh úsáid as CD3/CD28 agus IL-2 chun cealla T a ghníomhachtú ag a dtiúchain MNA faoi seach ar feadh 7 lá. Bailíodh an meán roimh agus tar éis 4 uair an chloig de spreagadh PMA/ionomycin. Tomhaiseadh tiúchain TNFα (E), IFN-γ (F) agus IL-2 (G) le ELISA. Léiríonn an graf barra an meán (n = 5 deontóir sláintiúil) + SEM. Luach P cinntithe ag baint úsáide as anailís aontreo ar athraitheas agus tomhais arís agus arís eile (*P<0.05). Léiríonn an líne poncaithe teorainn bhrath an bhrath. (H) Measúnú líseas cealla. Coigeartaíodh cealla FRα-CAR-T nó GFP-CAR-T le hadanóisín (250μM) nó MNA (10 mM) ar feadh 24 uair an chloig, nó fágadh gan chóireáil iad (Ctrl). Tomhaiseadh céatadán marú cealla SK-OV-3. Luach P cinntithe ag tástáil t Welch (*P<0.5 agus **P<0.01).
Chun tuiscint mheicníoch a fháil ar rialáil léirithe TNFα atá ag brath ar MNA, rinneadh meastóireacht ar na hathruithe in mRNA TNFα i gcealla T a ndearnadh cóireáil orthu le MNA (Fíor 5A). Léirigh cealla T deontóra sláintiúla a ndearnadh cóireáil orthu le MNA méadú faoi dhó ar leibhéil trascríobh TNFα, rud a léiríonn go bhfuil MNA ag brath ar rialáil trascríobh TNFα. Chun an mheicníocht rialála fhéideartha seo a imscrúdú, rinneadh meastóireacht ar dhá fhachtóir trascríobh aitheanta a rialaíonn TNFα, eadhon fachtóir núicléach cealla T gníomhachtaithe (NFAT) agus próitéin shonrach 1 (Sp1), mar fhreagairt ar cheangal MNA leis an bpromotóir TNFα proximal (30). Tá 6 shuíomh ceangailteach NFAT aitheanta agus 2 shuíomh ceangailteach Sp1 sa phromotóir TNFα, ag forluí ag suíomh amháin [-55 péire bonn (bp) ón 5'cap] (30). Léirigh imdhíon-dheascán crómatin (ChIP) nuair a rinneadh cóireáil air le MNA, go raibh méadú faoi thrí ar cheangal Sp1 leis an bpromotóir TNFα. Mhéadaigh ionchorprú NFAT freisin agus chuaigh sé i dtreo thábhacht (Fíor 5B). Léiríonn na sonraí seo go rialaíonn MNA léiriú TNFα trí thrascríobh Sp1, agus léiriú NFAT go pointe níos lú.
(A) I gcomparáid le cealla T a saothraíodh gan MNA, an t-athrú fillte ar léiriú TNFα i gcealla T a ndearnadh cóireáil orthu le MNA. Taispeántar an patrún léirithe le SEM (n = 5 deontóir sláintiúil). Léiríonn sé sonraí ó n = 3 thurgnamh neamhspleácha ar a laghad. (B) Promótóir TNFα na gcealla T a ndearnadh cóireáil orthu le nó gan 8 mM MNA tar éis NFAT agus Sp1 a chomhcheangal le (Ctrl) agus spreagadh PMA/ionomycin ar feadh 4 uair an chloig. Baineadh úsáid as imdhíonghlóbailin G (IgG) agus H3 mar rialuithe diúltacha agus dearfacha le haghaidh imdhíon-dheascáin, faoi seach. Léirigh cainníochtú ChIP gur mhéadaigh ceangal Sp1 agus NFAT leis an promótóir TNFα i gcealla a ndearnadh cóireáil orthu le MNA arís agus arís eile i gcomparáid leis an rialú. Léiríonn sé sonraí ó n = 3 thurgnamh neamhspleácha ar a laghad. Luach P cinntithe ag tástálacha t iolracha (*** P <0.01). (C) I gcomparáid le haiscítí HGSC, léirigh cealla T (neamh-chíteatocsaineach) méadú ar léiriú TNF sa meall. Léiríonn na dathanna othair éagsúla. Rinneadh sampláil randamach ar na cealla a taispeánadh go 300 agus cuireadh crith orthu chun ró-tharraingt a theorannú (** Padj = 0.0076). (D) Múnla molta de MNA le haghaidh ailse ubhagáin. Déantar MNA a tháirgeadh i gcealla meall agus i bhfibriblastaí i TME agus tógann cealla T suas é. Méadaíonn MNA ceangal Sp1 leis an bpromótóir TNFα, rud a fhágann go méadaítear trascríobh TNFα agus táirgeadh cítocín TNFα. Is cúis le laghdú ar IFN-γ freisin mar gheall ar MNA. Mar thoradh ar chosc ar fheidhm cealla T, laghdaítear an cumas marú agus luathaítear fás meall.
De réir tuairiscí, tá éifeachtaí frith-meall agus frith-meall ag TNFα atá ag brath ar an tosaigh agus ar an gcúl, ach tá ról aitheanta aige i gcur chun cinn fáis agus meiteastáis ailse ubhagáin (31-33). De réir tuairiscí, tá tiúchan TNFα in ascites agus fíocháin meall in othair a bhfuil ailse ubhagáin orthu níos airde ná i bhfíocháin neamhurchóideacha (34-36). I dtéarmaí meicníochta, is féidir le TNFα gníomhachtú, feidhm agus iomadú cealla fola bána a rialáil, agus feinitíopa cealla ailse a athrú (37, 38). Ag teacht leis na torthaí seo, léirigh anailís difreálach ar léiriú géine go raibh TNF suasrialaithe go suntasach i gcealla T i bhfíocháin meall i gcomparáid le haiscítí (Fíor 5C). Ní ​​raibh an méadú ar léiriú TNF le feiceáil ach i ndaonraí cealla T le feinitíopa neamh-chíteatocsaineach (Fíor S5A). Mar achoimre, tacaíonn na sonraí seo leis an tuairim go bhfuil dé-éifeachtaí imdhíon-choscacha agus meall-chur chun cinn ag MNA i HGSC.
Is é lipéadú fluaraiseach bunaithe ar chitiméadracht shreafa an príomhmhodh chun meitibileacht TIL a staidéar. Léirigh na staidéir seo, i gcomparáid le limficítí fola imeallacha nó cealla T ó orgáin limfóideacha tánaisteacha, go mbíonn claonadh níos airde ag TIL lucha agus daonna glúcós a ionghabháil (4, 39) agus cailliúint de réir a chéile feidhm mitochondrial (19, 40). Cé gur breathnaíodh torthaí comhchosúla sa staidéar seo, is é an phríomhfhorbairt ná meitibileacht cealla meall agus TIL ón bhfíochán meall céanna a baineadh amach a chur i gcomparáid. Ag teacht le cuid de na tuarascálacha roimhe seo, bíonn ionghabháil glúcóis níos airde ag cealla meall (CD45-EpCAM +) ó ascites agus meall ná cealla T CD8 + agus CD4 +, rud a thacaíonn leis an tuairim gur féidir ionghabháil ard glúcóis cealla meall a chur i gcomparáid le cealla T. Coincheap iomaíochta cealla T. TME. Mar sin féin, tá gníomhaíocht mitochondrial cealla meall níos airde ná gníomhaíocht cealla T CD8 +, ach tá an ghníomhaíocht mitochondrial cosúil le gníomhaíocht cealla T CD4 +. Neartaíonn na torthaí seo an téama atá ag teacht chun cinn go bhfuil meitibileacht ocsaídiúcháin tábhachtach do chealla meall (41, 42). Tugann siad le fios freisin go bhféadfadh cealla T CD8+ a bheith níos so-ghabhálaí i leith mífheidhm ocsaídiúcháin ná cealla T CD4+, nó go bhféadfadh cealla T CD4+ foinsí carbóin seachas glúcós a úsáid chun gníomhaíocht mitochondrial a choinneáil (43, 44). Ba chóir a thabhairt faoi deara nár thugamar faoi deara aon difríocht i nglacadh glúcóis ná i ngníomhaíocht mitochondrial idir éifeachtaí T CD4+, cuimhne éifeachtóra T agus cealla cuimhne lárnacha T in ascites. Ar an gcaoi chéanna, níl baint ar bith ag staid idirdhealaithe cealla T CD8+ i meall le hathruithe i nglacadh glúcóis, rud a aibhsíonn an difríocht shuntasach idir cealla T a shaothraítear in vitro agus TIL daonna in vivo (22). Deimhníodh na breathnuithe seo freisin trí úsáid a bhaint as leithdháileadh uathoibríoch neamhchlaonta daonra cealla, rud a léirigh tuilleadh go bhfuil cealla CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ a bhfuil glacadh glúcóis agus gníomhaíocht mitochondrial níos airde acu ná cealla meall ach go bhfuil daonra cealla gníomhacha meitibileach acu. Féadfaidh an daonra seo ionadaíocht a dhéanamh ar fho-dhaonra ionchasach cealla coisctheacha myeloid nó cealla deindríteacha plasmacytoid a sainaithníodh san anailís scRNA-seq. Cé gur tuairiscíodh an dá cheann seo i meall ubhagánach daonna [45], tá gá le tuilleadh oibre fós chun cur síos a dhéanamh ar an bhfo-dhaonra mielóideach seo.
Cé gur féidir le modhanna bunaithe ar chitiméadracht sreafa na difríochtaí ginearálta i meitibileacht glúcóis agus ocsaídiúcháin idir cineálacha cealla a shoiléiriú, níl na meitibilítí beachta a tháirgeann glúcós nó foinsí carbóin eile le haghaidh meitibileacht mitochondrial i TME socraithe go fóill. Éilíonn láithreacht nó neamhláithreacht meitibilítí a shannadh do fho-thacar TIL ar leith íonú an daonra cealla ón bhfíochán eiscthe. Dá bhrí sin, is féidir lenár modh saibhrithe cealla in éineacht le mais-speictriméadracht léargas a thabhairt ar na meitibilítí atá saibhrithe go difriúil i gcealla T agus i ndaonraí cealla meall i samplaí othar meaitseála. Cé go bhfuil buntáistí ag an modh seo thar shórtáil cealla gníomhachtaithe ag fluaraiseacht, d'fhéadfadh tionchar a bheith ag leabharlanna meitibilítí áirithe mar gheall ar chobhsaíocht dhúchasach agus/nó ráta láimhdeachais tapa (22). Mar sin féin, bhí ár modh in ann dhá mheitibilít imdhíon-choscacha aitheanta, adenosine agus kynurenine, a aithint toisc go bhfuil siad an-éagsúil idir cineálacha samplaí.
Tugann ár n-anailís mheitibileomach ar meall agus ar fhochineálacha TIL léargas níos fearr ar ról na meitibilítí i TME ubhagánach. Ar dtús, ag baint úsáide as cítiméadracht sreafa, chinneamar nach raibh aon difríocht i ngníomhaíocht mitochondrial idir meall agus cealla T CD4 +. Mar sin féin, léirigh anailís LC-MS/MS athruithe suntasacha i líonmhaireacht na meitibilítí i measc na ndaonraí seo, rud a léiríonn go bhfuil gá le léirmhíniú cúramach ar chonclúidí faoi mheitibileacht TIL agus a ghníomhaíocht meitibileach fhoriomlán. Ar an dara dul síos, is é MNA an meitibilít leis an difríocht is mó idir cealla CD45 agus cealla T in ascites, ní meall. Dá bhrí sin, d'fhéadfadh éifeachtaí difriúla a bheith ag urranna agus suíomh meall ar mheitibileacht TIL, rud a aibhsíonn an éagsúlacht fhéideartha i micri-thimpeallacht ar leith. Ar an tríú dul síos, tá léiriú an einsím MNA-tháirgthe NNMT teoranta go príomha do CAF, ar cealla meall iad go pointe níos lú, ach breathnaítear leibhéil MNA inbhraite i gcealla T díorthaithe ó mheall. Tá éifeacht aitheanta ailse-chur chun cinn ag ró-léiriú NNMT i CAF ubhagánach, go páirteach mar gheall ar chur chun cinn meitibileacht CAF, ionradh meall agus meiteastáis (27). Cé go bhfuil an leibhéal foriomlán TIL measartha, tá dlúthbhaint ag léiriú NNMT i CAF le fochineál meiseinceimeach Atlas Géanóim an Ailse (TCGA), a bhfuil drochphrognóis aige (27, 46, 47). Ar deireadh, tá léiriú an einsím AOX1 atá freagrach as díghrádú MNA teoranta freisin don daonra CAF, rud a léiríonn nach bhfuil an cumas ag cealla T MNA a mheitibiliú. Tacaíonn na torthaí seo leis an smaoineamh, cé go bhfuil gá le tuilleadh oibre chun an fhionnachtain seo a fhíorú, go bhféadfadh leibhéil arda MNA i gcealla T a léiriú go bhfuil micri-thimpeallacht CAF imdhíon-chosctha i láthair.
I bhfianaise an leibhéal íseal léirithe iompróirí MNA agus na leibhéil dobhraite de phróitéiní tábhachtacha atá bainteach le meitibileacht MNA, níltear ag súil le láithreacht MNA i gcealla T. Níorbh fhéidir NNMT ná AOX1 a bhrath trí anailís scRNA-seq agus qPCR spriocdhírithe de dhá chohórt neamhspleácha. Léiríonn na torthaí seo nach ndéanann cealla T MNA a shintéisiú, ach go n-ionsúitear é ón TME máguaird. Léiríonn turgnaimh in vitro go mbíonn claonadh ag cealla T MNA eisgéineach a charnadh.
Léirigh ár staidéir in vitro go spreagann MNA eisigineach léiriú TNFα i gcealla T agus go bhfeabhsaíonn sé ceangal Sp1 leis an bpromótóir TNFα. Cé go bhfuil feidhmeanna frith-meall agus frith-meall araon ag TNFα, in ailse ubhagánach, is féidir le TNFα fás ailse ubhagánach a chur chun cinn (31-33). Is féidir le neodrú TNFα i gcultúr cealla meall ubhagánach nó deireadh a chur le comhartha TNFα i samhlacha lucha táirgeadh cíteacáin athlastach idirghabhála TNFα a fheabhsú agus fás meall a chosc (32, 35). Dá bhrí sin, sa chás seo, is féidir le MNA díorthaithe ó TME gníomhú mar mheitibilít pró-athlastach trí mheicníocht atá ag brath ar TNFα tríd an lúb uath-chríneach, rud a chuireann chun cinn tarlú agus scaipeadh ailse ubhagánach (31). Bunaithe ar an bhféidearthacht seo, tá bac TNFα á staidéar mar ghníomhaire teiripeach féideartha le haghaidh ailse ubhagánach (37, 48, 49). Ina theannta sin, cuireann MNA isteach ar chiteatocsaineacht cealla CAR-T do chealla meall ubhagánach, rud a sholáthraíonn tuilleadh fianaise maidir le cosc ​​imdhíonachta idirghabhála MNA. Le chéile, tugann na torthaí seo le fios go bhfuil samhail ann ina ndéanann meall agus cealla CAF MNA a scaradh isteach i TME eachtarcheallach. Trí (i) spreagadh fáis ailse ubhagáin de bharr TNF agus (ii) cosc ​​ar ghníomhaíocht chíteatocsaineach cealla T de bharr MNA, d'fhéadfadh éifeacht dhúbailte meall a bheith aige seo (Fíor 5D).
Mar fhocal scoir, trí mheascán de shaibhriú tapa cealla, seicheamhú aoncheallach agus próifíliú meitibileach a chur i bhfeidhm, nocht an staidéar seo na difríochtaí ollmhóra imdhíon-mheitibileamacha idir meall agus cealla ascites in othair HGSC. Léirigh an anailís chuimsitheach seo go bhfuil difríochtaí i nglacadh glúcóis agus i ngníomhaíocht mitochondrial idir cealla T, agus shainaithin sé MNA mar mheitibileatán rialála imdhíonachta uathrialach neamhcheallach. Tá tionchar ag na sonraí seo ar an gcaoi a mbíonn tionchar ag TME ar mheitibileacht cealla T in ailse dhaonna. Cé gur tuairiscíodh an iomaíocht dhíreach maidir le cothaithigh idir cealla T agus cealla ailse, is féidir le meitibilítí gníomhú mar rialtóirí indíreacha freisin chun dul chun cinn meall a chur chun cinn agus b'fhéidir freagairtí imdhíonachta intíre a chosc. Féadfaidh cur síos breise ar ról feidhmiúil na meitibilítí rialála seo straitéisí malartacha a oscailt chun an freagairt imdhíonachta frith-meall a fheabhsú.
Fuarthas eiseamail othar agus sonraí cliniciúla trí stór fíocháin meall ailse BC atá deimhnithe ag Líonra Stór Fíocháin Cheanada. De réir an phrótacail atá ceadaithe ag Coiste Eitice Taighde Ailse BC agus Ollscoil British Columbia (H07-00463), fuair gach eiseamal agus sonraí cliniciúla othar toiliú feasach i scríbhinn nó thug siad suas a dtoiliú go foirmiúil. Stóráiltear na samplaí sa BioBank deimhnithe (BRC-00290). Taispeántar tréithe mionsonraithe an othair i dTáblaí S1 agus S5. Chun crió-chaomhnú, úsáidtear scalpel chun sampla meall an othair a dhíghrádú go meicniúil agus ansin é a bhrú trí scagaire 100 micrón chun fionraí cille aonair a fháil. Lártheifneoiríodh ascites an othair ag 1500 rpm ar feadh 10 nóiméad ag 4°C chun na cealla a mhilleadh agus an forshnáithín a bhaint. Rinneadh cealla a fuarthas ó meall agus ó ascites a chrio-chaomhnú i 50% séiream daonna AB díghníomhachtaithe teasa (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) agus 10% démheitil sulfoxíd. Leádh na fionraí cealla aonair chaomhnaithe seo agus úsáideadh iad chun meitibileacht agus meitibilít a chinneadh mar a thuairiscítear thíos.
Is éard atá sa mheán iomlán 0.22 μm scagtha 50:50 breise le RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glútamín (Thermo Fisher Scientific) breise le 10% séiream daonna AB díghníomhaithe le teas (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glútamín (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x tuaslagán Peinicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) agus 50 μMB-mearcaipteatánól. Cuirtear 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) agus 2 mM l-glútamín (Thermo Fisher Scientific) le AimV (Invitrogen). Bhí maolán ruaimnithe an chítiméadair sreafa comhdhéanta de 0.22μm saline maolaithe fosfáite scagtha (PBS; Invitrogen) breise le 3% séiream daonna AB díghníomhaithe le teas (Sigma). Tá an maolán saibhrithe cealla comhdhéanta de PBS scagtha 0.22μm agus tá 0.5% séiream daonna AB díghníomhaithe teasa (Sigma-Aldrich) curtha leis.
I meán iomlán 37°C, rinneadh na cealla a dhaite le 10 nM MT DR agus 100 μM 2-NBDG ar feadh 30 nóiméad. Ansin, rinneadh na cealla a dhaite le ruaim inmharthanachta eF506 ag 4°C ar feadh 15 nóiméad. Athfhionraí na cealla i FC Block (eBioscience) agus Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), caolaigh iad i maolán daite cítiméadair sreafa (de réir threoracha an mhonaróra), agus goir iad ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Daite na cealla le sraith antashubstaintí (Tábla S2) i maolán daite cítiméadair sreafa ag 4°C ar feadh 20 nóiméad. Athfhionraí na cealla i maolán daite cítiméadair sreafa (Cytek Aurora; cumraíocht 3L-16V-14B-8R) roimh an anailís. Bain úsáid as SpectroFlo agus FlowJo V10 chun sonraí comhaireamh cealla a anailísiú, agus bain úsáid as GraphPad Prism 8 chun na sonraí a chruthú. Rinneadh log-normalú ar dhéine fhluaraiseachta mheánach (MFI) 2-NBDG agus MT DR, agus ansin úsáideadh tástáil t péireáilte le haghaidh anailíse staitistiúla chun cuntas a thabhairt ar othair mheaitseáilte. Bain gach daonra a bhfuil níos lú ná 40 imeacht acu ón anailís; cuir isteach luach MFI de 1 le haghaidh aon luachanna diúltacha sula ndéantar anailís staitistiúil agus léirshamhlú sonraí.
Chun cur leis an straitéis geataithe láimhe den phainéal próisis thuas, d'úsáideamar an anótáil iomlán ón gcrann srianta cruthanna (FAUST) (21) chun cealla a shannadh go huathoibríoch don daonra tar éis cealla marbha a dhíchur i FlowJo. Bainistímid an t-aschur de láimh chun daonraí a chumasc a bhfuil cuma mhí-leithdháilte orthu (cealla PD1+ le cealla meall PD1 a chomhcheangal) agus daonraí coinnithe. Tá meán de níos mó ná 2% cealla i ngach sampla, le haghaidh 11 daonra san iomlán.
Baineadh úsáid as lártheifneoiriú dlúis grádáin Ficoll chun PBMC a dheighilt ó tháirgí deighilte leukocyte (STEMCELL Technologies). Aonraíodh cealla T CD8+ ó PBMC ag baint úsáide as CD8 MicroBeads (Miltenyi) agus leathnaíodh iad i meán iomlán ag baint úsáide as TransAct (Miltenyi) ar feadh 2 sheachtain de réir threoracha an mhonaróra. Ligeadh do na cealla seasamh ar feadh 5 lá i meán iomlán ina raibh IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), agus ansin athspreagadh iad le TransAct. Ar lá 7, de réir threoracha an mhonaróra, baineadh úsáid as CD45 MicroBeads daonna (Miltenyi) chun cealla a shaibhriú i dtrí bhabhta as a chéile. Roinneadh na cealla le haghaidh anailíse sreafa-chítiméadrachta (mar a thuairiscítear thuas), agus roinneadh milliún cealla trí huaire le haghaidh anailíse LC-MS/MS. Próiseáladh na samplaí le LC-MS/MS mar a thuairiscítear thíos. Mheasamar luach an mheitibileitíobáin atá ar iarraidh le huimhir ian de 1,000. Déantar gach sampla a normalú de réir líon iomlán na n-ian (TIC), a thiontú go logartamach agus a normalú go huathoibríoch i MetaboAnalystR roimh an anailís.
Rinneadh fionraí cille aonair gach othair a dhíreo agus a scagadh trí scagaire 40 μm isteach i meán iomlán (mar a thuairiscítear thuas). De réir phrótacal an mhonaróra, úsáideadh trí bhabhta as a chéile de roghnú dearfach trí dheighilt coirníní maighnéadacha ag baint úsáide as MicroBeads (Miltenyi) chun na samplaí a shaibhriú le haghaidh cealla CD8+, CD4+ agus CD45- (ar oighear). Go hachomair, déantar na cealla a athfhionraí i maolán saibhrithe cealla (mar a thuairiscítear thuas) agus a chomhaireamh. Goradh na cealla le coirníní CD8 daonna, coirníní CD4 daonna nó coirníní CD45 daonna (Miltenyi) ag 4°C ar feadh 15 nóiméad, agus ansin nite le maolán saibhrithe cealla iad. Cuirtear an sampla tríd an gcolún LS (Miltenyi), agus bailítear na codáin dearfacha agus diúltacha. Chun an fad a laghdú agus an chéim aisghabhála cealla a uasmhéadú, úsáidtear an codán CD8 ansin don dara babhta de shaibhriú CD4+, agus úsáidtear an codán CD4 don shaibhriú CD45 ina dhiaidh sin. Coinnigh an tuaslagán ar oighear i rith an phróisis deighilte.
Chun samplaí a ullmhú le haghaidh anailíse meitibilítí, niteadh na cealla uair amháin le tuaslagán salainn oighir-fhuar, agus cuireadh 1 ml de meatánól 80% le gach sampla, ansin corraíodh iad le vortex agus reoiteadh go tapa iad i nítrigin leachtach. Rinneadh trí thimthriall reo-leá ar na samplaí agus rinneadh lártheifneoiriú orthu ag 14,000 rpm ar feadh 15 nóiméad ag 4°C. Galaíodh an forshnáithín ina raibh na meitibilítí go dtí go raibh sé tirim. Aththuaslagadh na meitibilítí i 50 μl d'aigéad formach 0.03%, corraíodh iad le meascadh, agus ansin rinneadh lártheifneoiriú orthu chun smionagar a bhaint.
Bain na meitibilítí amach mar a thuairiscítear thuas. Aistrigh an forshreabhán chuig buidéal crómatagrafaíochta leachta ardfheidhmíochta le haghaidh taighde meitibileachta. Bain úsáid as prótacal cóireála randamach chun gach sampla a chóireáil le líon comhchosúil cealla chun éifeachtaí baisce a chosc. Rinneamar measúnú cáilíochtúil ar mheitibilítí domhanda a foilsíodh roimhe seo ar an Speictriméadar Mais Trí-Cheathairpholach AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Rinneadh anailís chromatagrafaíochta agus comhtháthú achar buaice ag baint úsáide as bogearraí MultiQuant leagan 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Baineadh úsáid as comhaireamh ian de 1000 chun luach an mheitibileitíobáin atá ar iarraidh a mheas, agus baineadh úsáid as TIC gach sampla chun achar buaic normalaithe gach meitibilít braite a ríomh chun ceartú a dhéanamh ar athruithe a tugadh isteach leis an anailís uirlise ó phróiseáil an tsampla. Tar éis an TIC a normalú, úsáidtear MetaboAnalystR(51) (paraiméadar réamhshocraithe) le haghaidh tiontú logartamach agus scálú uathoibríoch líne norm. D'úsáideamar PCA le pacáiste vegan R chun anailís taiscéalaíoch a dhéanamh ar dhifríochtaí meitibileachta idir cineálacha samplaí, agus d'úsáideamar anailís iomarcaíochta páirteach chun othair a anailísiú. Baineadh úsáid as modh Ward chun deindreagram léarscáile teasa a thógáil chun an fad Eoiclídeach idir samplaí a chnuasach. D'úsáideamar limma (52) ar líonmhaireacht meitibilít chaighdeánaithe chun meitibilítí flúirseacha difreálacha a aithint ar fud an chineáil chealla agus an mhicri-thimpeallacht ar fad. Chun an míniú a shimpliú, úsáidimid an paraiméadar meán grúpa chun an tsamhail a shonrú, agus breithnímid na cineálacha cealla sa mhicri-thimpeallacht mar gach grúpa (n = 6 ghrúpa); I gcás na tástála suntasachta, rinneamar trí thomhas athuair do gach meitibilít. Chun macasamhlú bréagach a sheachaint, cuireadh an t-othar san áireamh mar chonstaic i ndearadh an limma. Chun na difríochtaí i meitibilítí idir othair éagsúla a sheiceáil, choigeartaíomar samhail an limma ag cur othair san áireamh ar bhealach seasta. Tuairiscímid suntasacht an chodarsnachta réamhshonraithe idir an cineál cille agus micri-thimpeallacht Padj <0.05 (ceartú Benjamini-Hochberg).
Tar éis saibhriú fuinnimh ag baint úsáide as an Miltenyi Dead Cell Removal Kit (inmharthanacht >80%), rinneadh seicheamhú trascríptóim aoncheallach ar na samplaí ascites agus meall reoite beo iomlána ag baint úsáide as prótacal léirithe géine 10x 5′. Rinneadh anailís ar chúig chás le meall agus ascites meaitseála, cé gur chuir an inmharthanacht íseal ó shampla meall amháin cosc ​​​​ar a áireamh. Chun roghanna iolracha othar a bhaint amach, chomhcheanglaíomar samplaí gach othair i lánaí an rialaitheora cróimiam 10x, agus rinneamar anailís ar na suíomhanna ascites agus meall ar leithligh. Tar éis seicheamhú [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp foirceann péireáilte (PE), géanóm Québec; meán de 73,488 agus 41,378 léamh in aghaidh na cille le haghaidh meall agus ascites faoi seach]], d'úsáideamar CellSNP agus Vireo (53) (bunaithe ar CellSNP mar SNP daonna coitianta (VCF) a sholáthraíonn GRCh38. Úsáideamar SNPRelate chun an t-aitheantas is gaire (IBS) de stádas géinitíopa an othair (IBS) a thuar, gan cealla neamhshannta agus cealla a shainaithnítear mar dhúbailte agus deontóirí meaitseála idir samplaí ascites agus meall a áireamh (54). Ar bhonn an tasc seo, choinnigh muid trí chás le hionadaíocht fhlúirseach cille sa meall agus san ascites le haghaidh anailíse iartheachtach. Tar éis céim scagacháin maise a dhéanamh i bpacáistiú an scaitéara (55) agus an scráin (56), thug sé seo 6975 cealla (2792 agus 4183 cealla ó mheall agus ascites, faoi seach) le haghaidh anailíse. Úsáideamar braisliú Louvain igraph (57) ar líonra comharsanachta is gaire (SNN) bunaithe ar achar Jaccard chuig cealla braisle de réir léirithe. An Rinneadh braislí a anótáil de láimh le cineálacha cealla ionchasacha bunaithe ar léiriú géine marcóra agus rinneadh iad a shamhlú le t-SNE. Sainmhínítear cealla T cíteatocsaineacha trí léiriú CD8A agus GZMA, gan fo-bhraislí a bhfuil léiriú íseal próitéine ribosómach acu a áireamh. Rinneamar rochtain ar shonraí foilsithe Izar et al. (16), lena n-áirítear a n-ionchorprú t-SNE, ar féidir leis an bhforluí léirithe idir marcóirí cealla imdhíonachta agus léiriú NNMT a rialú.
Scaradh PBMC ó tháirgí scaradh leukocyte (STEMCELL Technologies) trí lártheifneoiriú dlúis grádáin Ficoll. Aonraíodh cealla CD3+ ó PBMC ag baint úsáide as coirníní CD3 (Miltenyi). I láthair nó as láthair MNA, gníomhaíodh cealla CD3+ le CD3 ceangailte le pláta (5μg/ml), CD28 intuaslagtha (3μg/ml) agus IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ar an lá deireanach den leathnú, rinneadh meastóireacht ar an inmharthanacht (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) agus an iomadú (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) trí shreabh-chítiméadracht. Déan feidhm an éifeachtóra a mheas trí chealla a spreagadh le PMA (20 ng/ml) agus ionomycin (1μg/ml) le GolgiStop ar feadh 4 huaire an chloig, agus déan monatóireacht ar CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) agus iseitiocianáit TNFα-fluaraiséine (FITC) (MAb11, BD). Spreag cealla qPCR agus ChIP le PMA (20 ng/ml) agus ionomycin (1μg/ml) ar feadh 4 huaire an chloig. Bailíodh an forshreabhán ELISA roimh agus tar éis spreagadh le PMA (20 ng/ml) agus ionomycin (1 μg/ml) ar feadh 4 huaire an chloig.
Lean prótacal an mhonaróra chun RNA a leithlisiú ag baint úsáide as an trealamh RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Bain úsáid as QIAshredder (QIAGEN) chun an sampla a homaiginiú. Bain úsáid as an trealamh RNA ardacmhainne go cDNA (Thermo Fisher Scientific) chun DNA comhlántach (cDNA) a shintéisiú. Bain úsáid as TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) chun léiriú géine a chainníochtú (de réir phrótacal an mhonaróra) leis na tóireadóirí seo a leanas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliocraldehyde-3-fosfáit as Hidrigin (GAPDH)] agus Hs01010726_m1 (SLC22A2). Rinneadh na samplaí a rith ar chóras PCR fíor-ama StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) sa phláta imoibrithe optúil thapa 96-tobar MicroAmp (Applied Biosystems) le scannán optúil MicroAmp. Meastar go bhfuil aon luach Ct a sháraíonn 35 os cionn an tairsí braite agus marcáiltear é mar neamh-inbhraite.
Déan ChIP mar a thuairiscíodh roimhe seo (58). Go hachomair, rinneadh na cealla a chóireáil le formaildéad (tiúchan deiridh 1.42%) agus goradh iad ag teocht an tseomra ar feadh 10 nóiméad. Bain úsáid as maolán ata forlíonta (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl agus 0.1% NP-40) ar oighear ar feadh 10 nóiméad, ansin athfhionraí iad i maolán imdhíon-dheascáin mar a thuairiscítear (58). Rinneadh an sampla a soniciú ansin leis na timthriallta seo a leanas: 10 timthriall (20 cuisle 1 soicind) agus am statach de 40 soicind. Goradh antashubstaintí imdhíonglobulin G grád ChIP (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) agus SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) leis an sampla ag 4°CC agus croith thar oíche. Gor coirníní próitéine A (Thermo Fisher Scientific) leis an sampla ag 4°C agus croitheadh ​​go réidh iad ar feadh 1 uair an chloig, ansin bain úsáid as coirníní chelex (Bio-Rad) chun an DNA a shaibhriú, agus bain úsáid as próitéináis K (Thermo Fisher) le haghaidh díleá próitéine. Braitheadh ​​​​promótóir TNFα trí PCR: ar aghaidh, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; os a choinne sin, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (táirge 207-bp). Tháirg Image Lab (Bio-Rad) na híomhánna agus rinneadh iad a chainníochtú ag baint úsáide as bogearraí ImageJ.
Bailíodh an forshnáithín cultúir cille mar a thuairiscítear thuas. Rinneadh an cinneadh de réir nósanna imeachta an mhonaróra maidir le trealamh ELISA TNFα daonna (Invitrogen), trealamh ELISA IL-2 daonna (Invitrogen) agus trealamh ELISA IFN-γ daonna (Abcam). De réir phrótacal an mhonaróra, caolaíodh an forshnáithín 1:100 chun TNFα agus IL-2 a bhrath, agus 1:3 chun IFN-γ a bhrath. Bain úsáid as Léitheoir Illipéid EnVision 2104 (PerkinElmer) chun ionsú a thomhas ag 450 nm.
Scaradh PBMC ó tháirgí scaradh leukocyte (STEMCELL Technologies) trí lártheifneoiriú dlúis grádáin Ficoll. Aonraíodh cealla CD3+ ó PBMC ag baint úsáide as coirníní CD3 (Miltenyi). I láthair nó as láthair MNA, gníomhaíodh cealla CD3+ le CD3 ceangailte le pláta (5μg/ml), CD28 intuaslagtha (3μg/ml) agus IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ar feadh 3 lá. Tar éis 3 lá, bailíodh na cealla agus nite le saline 0.9%, agus reoiteadh an millín go tapa. Rinneadh comhaireamh cealla trí shreabh-chítiméadracht (Cytek Aurora; cumraíocht 3L-16V-14B-8R) ag baint úsáide as 123count eBeads.
Meitibilítí an sliocht mar a thuairiscítear thuas. Athchóiríodh an sliocht triomaithe ag tiúchan de 4000 coibhéis cille/μl. Déan anailís ar an sampla trí chrómatagrafaíocht chéime droim ar ais (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) agus colún CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, méid na gcáithníní 1.6-μm, méid na bpoll 120-Å; #186008500, Waters). Mais-speictriméadar polar (6470, Agilent), ina n-oibríonn ianú leictreaspraeála i mód dearfach. Is é 0.1% aigéad formach (i H2O) céim shoghluaiste A, is é 90% aicéatóinítríl, 0.1% aigéad formach céim shoghluaiste B. Is é an grádán LC ná 0 go 2 nóiméad do 100% A, 2 go 7.1 nóiméad do 99% B, agus 7.1 go 8 nóiméad do 99% B. Ansin, athchothromaigh an colún le céim shoghluaiste A ag ráta sreafa 0.6 ml/nóim ar feadh 3 nóiméad. Is é 0.4ml/nóim an ráta sreafa, agus téitear seomra an cholúin go 50°C. Bain úsáid as caighdeán ceimiceach íon MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Ceanada) chun am coinneála (RT) agus claochlú (RT = 0.882 nóiméad, claochlú 1 = 137→94.1, claochlú 2 = 137→92, Comhshó 3 = 137→78) a bhunú. Nuair a tharlaíonn na trí aistriú ag an am coinneála ceart, úsáidtear aistriú 1 le haghaidh cainníochtaithe chun sainiúlacht a chinntiú. Gineadh cuar caighdeánach MNA (Toronto Research Chemical Company) trí shé chaolú sraitheach den tuaslagán stoic (1 mg/ml) chun caighdeáin de 0.1, 1.0, 10 agus 100 ng/ml agus 1.0 agus 10μg/ml faoi seach a fháil mar leacht. Is é 1 ng/ml an teorainn bhrath, agus tá an freagairt líneach idir 10 ng/ml agus 10μg/ml. Úsáidtear gach instealladh de dhá mhicrilítear den sampla agus den chaighdeán le haghaidh anailíse LC/MS, agus ritear sampla rialaithe cáilíochta measctha gach ocht n-instealladh chun cobhsaíocht an ardáin anailíse a chinntiú. Bhí freagairtí MNA na samplaí cille uile a ndearnadh cóireáil orthu le MNA laistigh de raon líneach an anailíse. Rinneadh anailís sonraí ag baint úsáide as bogearraí anailíse cainníochtúla MassHunter (v9.0, Agilent).
Tógadh an dara glúin den tógáil αFR-CAR ó Song et al. (59). Go hachomair, tá an méid seo a leanas sa tógáil: seicheamh ceannaire CD8a, blúire athraitheach aon-slabhra αFR-shonrach daonna, réigiún insí agus trasmembrane CD8a, fearann ​​​​incheallach CD27 agus fearann ​​​​incheallach CD3z. Sintéiseadh an seicheamh CAR iomlán le GenScript, agus ansin clónáladh é isteach sa veicteoir léirithe lentivíreasach dara glúin suas an sruth ón gcaiséad léirithe GFP a úsáideadh chun éifeachtúlacht an trasduchtaithe a mheas.
Déantar lentivíreas a tháirgeadh trí thrasfheistiú cealla HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); fásadh é i meán modhnaithe Dulbecco's Eagle ina bhfuil 10% séiream féatais bólachta (FBS) agus 1% PenStrep, agus úsáideadh veicteoir CAR-GFP agus úsáideann na plasmaidí pacáistithe (psPAX2 agus pMD2.G, Addgene) aimín lipofeictiúcháin (Sigma-Aldrich). Bailíodh an forshnáithín ina raibh an víreas 48 agus 72 uair an chloig tar éis an trasfheistiúcháin, scagadh é, agus comhchruinníodh é trí ultra-lártheifneoiriú. Stóráil an forshnáithín víreasach comhchruinnithe ag -80°C go dtí go ndéantar é a thrasduchtú.
Déantar PBMC a dheighilt ó tháirgí deighilte leukocyte deontóra sláintiúla (STEMCELL Technologies) trí lártheifneoiriú dlúis grádáin Ficoll. Bain úsáid as micrea-choirníní CD8 roghnúcháin dhearfaigh (Miltenyi) chun cealla CD8+ a leithlisiú ó PBMC. Spreag cealla T le TransAct (Miltenyi) agus i meán TexMACS [Miltenyi; curtha leis le 3% serum daonna díghníomhaithe teasa, 1% PenStrep agus IL-2 (300 U/ml)]. Ceithre huaire is fiche tar éis an spreagtha, rinneadh trasduchtú ar chealla T le lentivíreas (10 μl den fhorshnáithín víris tiubhaithe in aghaidh gach 106 cealla). 1 go 3 lá tar éis trasduchtú ar Cytek Aurora (ar FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), déan meastóireacht ar léiriú GFP na gcealla chun éifeachtúlacht trasduchtú de 30% ar a laghad a léiriú.
Rinneadh cealla CAR-T a shaothrú ar feadh 24 uair an chloig in Immunocult (STEMCELL Technologies; curtha leis le 1% PenStrep) faoi na coinníollacha seo a leanas: gan chóireáil, cóireáilte le 250 μM adenosine nó 10 mM MNA. Tar éis réamhchóireála, niteadh cealla CAR-T le PBS agus cuireadh le chéile iad le 20,000 cealla SK-OV-3 [ATCC; i meán McCoy 5A (Sigma-Aldrich) curtha leis le 10% FBS agus 1% PenStrep ag 10: Rinneadh an cóimheas éifeachtóra le sprioc de 1 a aimpliú faoi thrí i meán Immunocult curtha leis. Baineadh úsáid as cealla SK-OV-3 agus cealla SK-OV-3 a ndearnadh lysis orthu le saponin digitalis (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) mar rialuithe diúltacha agus dearfacha, faoi seach. Tar éis 24 uair an chloig de chomhshaothrú, bailíodh an forshnáithín agus tomhaiseadh an lachtáit díhiodráiteas (LDH) de réir threoracha an mhonaróra (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Caolaíodh an forshnáithín LDH 1:50 i maolán LDH. Tomhaiseadh céatadán an mharaithe ag baint úsáide as an bhfoirmle seo a leanas: céatadán an mharaithe = céatadán ceartúcháin / uasráta maraithe x 100%, áit a bhfuil céatadán an cheartúcháin = comhchultúr-chealla T amháin, agus uasráta maraithe = rialú dearfach-rialú diúltach.
Mar a thuairiscítear sa téacs nó sna hábhair agus sna modhanna, bain úsáid as GraphPad Prism 8, Microsoft Excel nó R v3.6.0 le haghaidh anailíse staitistiúla. Má bhailítear samplaí iolracha ón othar céanna (amhail ascites agus meall), úsáidimid tástáil t péireáilte nó cuirimid an t-othar san áireamh mar éifeacht randamach i samhail líneach nó ginearálaithe de réir mar is iomchuí. Chun anailís meitibileachta, déantar an tástáil tábhachta faoi thrí.
Le haghaidh ábhar breise don alt seo, féach http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Is alt rochtana oscailte é seo atá dáilte faoi théarmaí an Cheadúnais Creative Commons Attribution-Non-Commercial, a cheadaíonn an úsáid, an dáileadh agus an atáirgeadh in aon mheán, fad is nach chun críche tráchtála atá an úsáid deiridh agus gurb é an bunphrionsabal go bhfuil an saothar bunaidh ceart. Tagairt.
Nóta: Ní iarrann muid ort ach do sheoladh ríomhphoist a sholáthar ionas go mbeidh a fhios ag an duine a mholann tú don leathanach gur mian leat go bhfeicfidís an ríomhphost agus nach turscar é. Ní ghabhfaimid aon seoltaí ríomhphoist.
Úsáidtear an cheist seo chun tástáil a dhéanamh an cuairteoir thú agus chun cosc ​​a chur ar chur isteach turscair uathoibríoch.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardin. Jones), G. Russell Jones (R. Jones) Hamilton (Phineas T.
Cuireann MNA le cosc ​​imdhíonachta cealla T agus is sprioc imdhíoneolaíochta ionchasach í le haghaidh cóireáil ailse i ndaoine.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardin. Jones), G. Russell Jones (R. Jones) Hamilton (Phineas T.
Cuireann MNA le cosc ​​imdhíonachta cealla T agus is sprioc imdhíoneolaíochta ionchasach í le haghaidh cóireáil ailse i ndaoine.
©2021 Cumann Meiriceánach um Chur Chun Cinn na hEolaíochta. gach ceart ar cosaint. Tá AAAS ina chomhpháirtí de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. EolaíochtAdvances ISSN 2375-2548.